综述：液滴数字CRISPR用于核酸检测

《Advanced Science》：Droplet Digital CRISPR for Nucleic Acid Detection

这篇综述系统阐述了液滴数字CRISPR（ddCRISPR）技术如何将CRISPR系统的高序列特异性与液滴数字微流控的绝对定量能力相结合，为核酸检测提供了高灵敏度、高精密度和高通量的解决方案。文章详细介绍了ddCRISPR的核心原理、工作流程（包括液滴生成、操控与检测）、信号检测策略（涵盖无扩增和等温扩增辅助方法），并重点讨论了其在病毒（如HPV、SARS-CoV-2）、细菌及其他DNA/RNA生物标志物检测中的代表性应用。同时，综述也分析了当前面临的挑战（如工作流程自动化、液滴稳定性、多重检测）和未来展望（如人工智能辅助分析、床旁检测集成），旨在推动该技术从实验室研究向稳健、可扩展的诊断方案转化。

　　

液滴数字CRISPR（ddCRISPR）技术原理与工作流程

ddCRISPR技术是一种创新的核酸检测平台，它巧妙地将CRISPR-Cas系统的可编程、序列特异性识别能力与液滴数字微流控技术的绝对定量优势相结合。其核心在于将样品分割成数千至数百万个皮升级的微液滴，每个液滴作为一个独立的微反应器。当目标核酸分子被随机分配至这些液滴中时，遵循泊松（Poisson）分布原理。在含有目标分子的液滴（阳性液滴）中，CRISPR-Cas系统（如Cas12a、Cas13a）被激活，并发挥其“附带切割”活性，切割报告分子（如带有淬灭基团的单链DNA或RNA荧光探针），从而产生荧光信号。而不含目标分子的液滴（阴性液滴）则无荧光信号。通过统计阳性液滴的比例，即可根据泊松统计公式（λ = -ln(1 - p)，其中p为阳性液滴比例，λ为每个液滴中的平均目标分子数）实现对待测核酸的绝对定量，无需依赖标准曲线。这种数字化计数方式显著提高了检测的灵敏度（可达单分子水平）和精密度，并有效降低了复杂样本中抑制物的干扰。

液滴的生成、操控与检测是ddCRISPR工作流程的关键环节。液滴生成策略主要分为被动式（如流动聚焦、T型结、共流、阶跃乳化）和主动式（如电控、声表面波、机械振动）。生成单分散性高、尺寸均一的液滴对于保证定量准确性至关重要。液滴生成后，可能需要进行混合、融合、注入（如皮升注射）或分裂等操控步骤，以实现试剂的均匀混合、控制反应时序或执行多步反应，这对于提高检测的同步性和降低背景信号具有重要意义。最终，通过光学荧光检测、激光诱导荧光检测（如荧光激活液滴分选FADS）或电学检测等方法对每个液滴的荧光信号进行读取，区分阳性与阴性液滴，完成数字化定量。

信号检测策略：无扩增与等温扩增辅助ddCRISPR

ddCRISPR的信号检测策略主要分为无扩增和等温扩增辅助两大类。

无扩增ddCRISPR策略直接依赖于液滴内单分子目标核酸激活CRISPR-Cas系统所产生的信号。其优势在于流程简单、速度快、避免了扩增带来的污染风险和非特异性问题。当单个目标分子被限制在皮升级液滴中时，其局部浓度足以激活Cas酶，单个激活的Cas酶可切割超过10⁴个报告分子，产生强烈的局部荧光爆发，从而实现单分子检测。该策略在检测微小RNA（miRNA）等短片段核酸时显示出独特优势。

然而，对于极低浓度的目标物，通常需要借助等温扩增技术来预放大目标核酸，再将扩增产物与CRISPR检测系统结合，即扩增辅助ddCRISPR策略。常用的等温扩增方法包括：

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  环介导等温扩增（LAMP）：使用4-6条引物，在60-65°C下高效扩增，产生复杂的茎环结构DNA产物。LAMP-ddCRISPR灵敏度高，但引物设计复杂，存在非特异性扩增风险。
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  重组酶聚合酶扩增（RPA/RAA）：利用重组酶-引物复合物在37-42°C常温下进行扩增，反应快速（5-20分钟），对设备要求低，更适合现场检测。RPA/RAA与ddCRISPR联用，在液滴分隔环境下可减少引物二聚体等非特异性扩增。
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  滚环扩增（RCA）：基于环状模板进行线性扩增，产生长的串联重复序列，为Cas酶提供多个识别位点，有助于信号放大。特别适用于miRNA或短DNA片段检测。
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  超分支滚环扩增（HCA）：产生高度分支的DNA结构，实现指数级信号放大。

扩增辅助策略虽然提高了灵敏度，但也增加了检测的复杂性和时间，以及交叉污染的可能性。选择无扩增还是扩增辅助策略需根据检测灵敏度、速度、样本类型和实际应用场景的需求权衡。

ddCRISPR在核酸生物标志物检测中的应用

ddCRISPR技术已在多种核酸生物标志物的检测中展现出巨大潜力，应用范围覆盖DNA和RNA靶标。

DNA生物标志物检测

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  人乳头瘤病毒（HPV）DNA：HPV感染是宫颈癌等疾病的主要诱因。ddCRISPR平台如PADLOCK-CRISPR（结合RPA预扩增和Cas13a检测）、d³CRISPR（无扩增Cas12a检测）等，已成功用于HPV16/18等亚型的绝对定量，检测限低至1-5拷贝/微升，与qPCR结果高度一致，在临床样本检测中表现出色。
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  其他病毒DNA：针对JC病毒（JCV）、非洲猪瘟病毒（ASFV）、 Epstein-Barr病毒（EBV）、乙型肝炎病毒（HBV）等的ddCRISPR检测方法也被开发出来。例如，结合RPA的数字化CRISPR/Cas13a平台（MdCaR）检测JCV DNA的灵敏度比qPCR高100倍。无扩增液滴Cas12a检测可定量ASFV、EBV、HBV等。
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  致病菌DNA：在食品安全和临床诊断中，ddCRISPR用于检测如沙门氏菌（靶向invA基因）、大肠杆菌、李斯特菌等病原菌。例如，DropCRISPR平台结合LAMP与Cas12a，可在复杂基质（如生牛奶）中检测低至10²CFU/mL的活菌。多重ddCRISPR检测能同时鉴定多种病原体。

RNA生物标志物检测

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  SARS-CoV-2 RNA：在COVID-19疫情期间，ddCRISPR被广泛应用于SARS-CoV-2 RNA的检测。策略包括RT-LAMP结合Cas12b的ddRECD平台、RT-RAA结合Cas12a的平台等，均实现了高灵敏度和定量检测。无扩增的ultralocalized Cas13a平台甚至可在15分钟内实现单分子水平的SARS-CoV-2 RNA检测。
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  其他病毒RNA：如甲型流感病毒、发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）、寨卡病毒（ZIKV）、HIV等病毒的RNA也可通过ddCRISPR进行检测。一锅法数字RPA–Cas13a检测等方案简化了流程。
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  微小RNA（miRNA）：miRNA是重要的疾病标志物，尤其与癌症相关。无扩增的ddCRISPR（如PddCas13a assay, ultralocalized Cas13a assay）能够直接、高灵敏度地检测miR-21、miR-17、circHIPK3等分子，在癌症液体活检和诊断中具有应用前景。

挑战与未来展望

尽管ddCRISPR技术优势明显，但其走向广泛应用仍面临一些挑战：

1. 1.
   自动化与便携性：当前许多ddCRISPR工作流程涉及多个手动步骤，限制了其在床旁或资源有限环境下的应用。开发全自动、集成化的微型设备是未来的重要方向。无仪器或低仪器依赖的液滴生成方法（如重力驱动、离心微流控、涡旋乳化）有助于简化操作。
2. 2.
   液滴稳定性与均一性：液滴的蒸发、融合以及尺寸不均会影响定量准确性。优化表面活性剂、芯片材料和液滴生成条件至关重要。
3. 3.
   多重检测能力：同时检测多个靶标是提高诊断效率的关键。通过光谱编码、振幅编码或条形码策略实现多重ddCRISPR检测是研究热点，但也面临信号串扰等挑战。
4. 4.
   检测灵敏度与特异性平衡：特别是在无扩增策略中，如何进一步提高对极低丰度靶标的检测灵敏度，同时保持高特异性，需要优化Cas酶、报告系统及反应条件。
5. 5.
   成本与可及性：降低试剂和设备成本，使技术更易于推广。

未来，ddCRISPR技术的发展将受益于多个方向的进步：

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  人工智能（AI）驱动诊断：AI算法可用于优化液滴生成参数、提高液滴图像分析和分类的准确性及效率，实现实时反馈控制，提升检测的稳健性和自动化水平。
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  床旁检测（POCT）集成：结合智能手机读值、低成本芯片材料和便携式设备开发，将使ddCRISPR更适用于现场快速诊断。
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  新型CRISPR系统与材料：探索具有更高活性、更广PAM序列兼容性或新功能的Cas变体，以及开发更稳定的液滴体系和反应载体，将拓宽应用范围并提升性能。

结论

液滴数字CRISPR（ddCRISPR）技术通过将CRISPR的精准识别与液滴微流控的数字化定量能力深度融合，为核酸检测领域带来了革命性的进步。其在灵敏度、特异性、定量准确性以及应对复杂样本方面的卓越表现，使其在疾病诊断、病原体监测、食品安全和环境检测等领域展现出巨大的应用潜力。尽管在自动化、多重检测和便携性方面仍需进一步突破，但随着技术的不断成熟和创新，ddCRISPR有望发展成为下一代分子诊断的核心工具，为精准医疗和公共卫生安全提供强大支撑。