《Journal of Molecular Structure》：Integrated Computational and Experimental Identification of High-Affinity Aptamers for Aflatoxin B
1 Detection
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本研究采用计算与实验结合的方法筛选并验证了针对黄曲霉毒素B1的高亲和力aptamer。通过分子对接和分子动力学模拟确定候选aptamer的结构稳定性，结合SYBR Green I荧光法验证，发现L2 aptamer结合性能最优（Kd为-3.24 nM），验证了计算模型的可靠性，为快速开发高效生物传感器提供了新策略。
Shazia Shareef | Hariprasad P
环境生物技术实验室，农村发展与技术中心，印度理工学院德里分校，Hauz Khas，新德里 110016
摘要
黄曲霉毒素B1（AFB1）是一种高毒性和致癌性的黄曲霉毒素，广泛污染食品和饲料商品。开发出具有高度特异性和敏感性的检测方法对于食品安全和环境健康至关重要。在本研究中，采用了一种结合计算和实验的方法来确定针对AFB1的适配体。首先通过分子对接分析了17种适配体，以评估它们与AFB1的结合亲和力。从早期体外研究中选出的前4种适配体CPMA1、L1、L2和L3进一步进行了分子动力学（MD）模拟，以分析其结构动态和结合稳定性。分析了RMSD、RMSF、回转半径（Rg）、可接触溶剂表面积（SASA）和氢键相互作用等参数。还进行了自由能景观（FEL）分析，以研究构象能量状态和稳定性。FEL分析表明，所有4种适配体在结合AFB1后都采用了稳定的构象。通过基于SYBR Green I的无标记荧光测定法进行了体外验证，证明所有4种适配体的荧光强度均随浓度降低。其中，L2适配体表现出最强的荧光响应和最低的解离常数（Kd：-3.24 nM），显示出对AFB1最高的结合亲和力。这一结果与计算预测和先前的实验结果一致。总体而言，这种结合方法强调了将计算机建模与体外验证相结合的有效性，为设计高亲和力适配体以用于各种目标检测和生物传感器应用提供了一种成本和时间效益高的方法。
引言
黄曲霉毒素B1（AFB1）被认为是最强烈且最常见的污染物，经常污染多种食品和饲料商品，包括玉米、花生、香料和谷物[1,2]。由于其高致癌性、致突变性和肝毒性，AFB1被国际癌症研究机构（IARC）列为I类人类致癌物。即使是在微量水平下，长期暴露于AFB1也可能导致严重的健康问题，包括肝癌、免疫抑制和儿童生长迟缓[3,4]。这些严重的健康风险，加上严格的国际监管限制，突显了迫切需要可靠、敏感和快速的AFB1检测策略。
传统的AFB1检测方法，如高效液相色谱[5]、液相色谱-质谱（LC-MS）[6]和酶联免疫吸附测定（ELISA）[7]虽然具有高灵敏度，但通常成本高昂、耗时较长，并且需要复杂的样品制备和熟练的技术人员。相比之下，基于适配体的生物传感器因其高亲和力、特异性、稳定性、易于修饰和成本效益而成为有前景的替代方案。适配体是短的单链寡核苷酸，能够以高选择性结合各种目标[8]，使其非常适合在多种应用中检测微量分析物。尽管有这些优势，但由于对适配体折叠、结合机制和结构-功能关系的理解有限，高性能适配体基传感器的开发往往受到阻碍，而这些对于合理设计传感器至关重要。
实验技术如核磁共振（NMR）光谱和X射线晶体学已被用于研究适配体-目标相互作用[9]；然而，由于成本高昂、技术复杂性以及适配体-配体共晶结构的有限可用性，这些方法的应用受到限制。与RNA适配体相比，DNA适配体更受青睐，因为它们具有更好的化学稳定性，并适用于生物传感应用，但由于缺乏可靠的DNA结构预测和优化工具，准确表征DNA适配体-配体复合物存在挑战[10]。
在这种情况下，计算方法通过实现快速筛选、结构分析和在实验验证之前的机制理解，提供了一种克服这些限制的强大手段[11]。诸如二级和三级结构预测、分子对接[12]、分子动力学（MD）模拟[13]和自由能景观（FEL）分析[14]等技术提供了关于适配体-配体复合物结合模式、构象灵活性和动态稳定性的补充见解。然而，仅靠计算预测可能无法完全捕捉结合亲和力或功能性能，因此需要与实验验证相结合以确保可靠性。
在本研究中，我们提出了一个结合计算和实验的框架，作为评估适配体的合理且可扩展的策略，使用AFB1作为模型目标[15]。使用了一系列计算机工具，包括MFold、RNA Composer、Discovery Studio和PyMOL，来预测选定适配体的二级和三级结构。然后通过分子对接和MD模拟进一步分析它们的结合亲和力和结构稳定性。进行了FEL分析，以研究AFB1适配体复合物的构象动态。为了验证这些预测，采用基于SyBr Green-I的无标记荧光测定法，该方法依赖于适配体结合目标时的结构变化，用于实验评估适配体的结合性能。通过结合计算筛选和实验确认，这项概念验证研究突显了综合方法在改进适配体选择、减少实验负担以及指导下一代基于适配体的生物传感器开发方面的优势。
软件和服务器
MFold/UNAfold、RNAComposer、QRNAS软件、PyMOL软件、BioVia Discovery Studio软件、AutoDock Tools (ADT) 1.5.6和GROMACS 2019.4。
化学品和试剂
AFB1从Sigma-Aldrich购买。SYBR? Green I核酸凝胶染料从Thermo Fisher Scientific采购。所有其他化学品均从SRL, India获得。所有适配体的序列[15]在补充文件（表S1）中提供。
选定适配体的ssDNA二级结构预测
ssDNA二级结构的预测提供了关于核酸适配体折叠行为和结构稳定性的宝贵见解。结果揭示了多样的折叠模式，从简单的茎-环结构到包含多个环和突起的更复杂构象不等。这些变化突显了ssDNA适配体固有的结构灵活性及其根据核苷酸序列采用不同构象的能力。
结论
在本研究中，计算方法提供了关于适配体结构和功能特性的宝贵理解，特别是在它们与AFB1的相互作用方面。二级和三级结构的预测揭示了多样的折叠模式和稳定的构象，为进一步分析奠定了坚实的基础。分子对接研究表明17种适配体之间存在有利的结合相互作用，其中表现最佳的候选体表现出强大的相互作用
CRediT作者贡献声明
Shazia Shareef：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、可视化、验证、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。Hariprasad P：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、监督、项目管理、资金获取、正式分析、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者衷心感谢德里印度理工学院院长为进行这项研究提供了必要的基础设施和支持。Shazia Shareef感谢印度科学与工业研究委员会（CSIR）提供的奖学金支持（09/086(1327)/2018-EMR I）。作者还感谢德里IHRF-IIT和印度政府科技部（DST）提供的财政援助（DST/TDT/DDP-16/2018 (C)）。
