《Journal of Neuroimmunology》：Exosomes derived from neural stem cells contribute to cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting autophagy in rats
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神经干细胞来源外泌体通过抑制过度自噬减轻脑缺血再灌注损伤，降低神经评分、脑梗死体积和水肿，调控IL-4/IL-10和TNF-α/IL-6失衡，并减少Beclin-1/Atg-5/LC3表达。
李雄|霍思颖|袁阳|张琪|李俊杰|白文雅|刘佳|邵建林
中国昆明医科大学第一附属医院麻醉科
摘要
背景
脑缺血-再灌注损伤（CIRI）是中风的关键病理机制。外泌体（EXOs）是由细胞释放的生物囊泡，含有其来源细胞的活性成分和功能特性。本研究探讨了人神经干细胞来源的外泌体（hNSC-EXOs）对CIRI大鼠模型的影响，重点关注神经元自噬现象，并为未来CIRI管理的临床干预提供了新的理论基础。
方法
在体内和体外追踪了PKH26标记的hNSC-EXOs。建立CIRI模型后，给予hNSC-EXOs进行治疗。在术后24小时比较了脑损伤和炎症因子的变化。通过检测Beclin-1、Atg-5和LC3B的表达，并使用透射电子显微镜（TEM）观察大鼠右脑皮层的自噬体数量，来评估hNSC-EXOs对神经元自噬的影响。
结果
hNSC-EXO的平均粒径和浓度分别为64.47纳米和8.96×1010/毫升。PKH26标记的hNSC-EXOs被BV2和HT22细胞摄取，在体内主要位于脑损伤区域，其总通量具有时间依赖性。hNSC-EXO治疗降低了CIRI模型中的神经功能评分、脑梗死体积和脑水肿。脑组织染色显示，hNSC-EXO减轻了CIRI模型中的尼氏小体损伤和神经元凋亡。在炎症因子方面，hNSC-EXO增加了血清中的IL-4和IL-10水平，同时降低了TNF-α、iNOS和IL-6的水平。值得注意的是，hNSC-EXO降低了CIRI模型脑组织中Beclin-1、Atg-5和LC3的表达以及自噬体的数量。
结论
hNSC-EXOs对CIRI具有拮抗作用，能有效抑制过度的神经元自噬，减少炎症反应和神经元凋亡。
引言
中风是一种血管起源的神经系统疾病。作为一种普遍且复发的神经系统疾病，中风是全球致残和死亡的第二大原因（Waldman等人，2024年）。缺血性中风占所有中风病例的80%左右，是最常见的类型（Saini等人，2021年）。在中国，中风的估计患病率为2.6%，发病率和死亡率分别为每10万人年505.2例和343.4例（Tu等人，2023年）。减轻或预防脑缺血引起的神经元损伤的主要策略是恢复脑血流灌注。然而，血流的重新建立可能会进一步造成伤害或加重神经系统功能损伤，这种现象称为脑缺血-再灌注损伤（CIRI）（Sun等人，2018年；Zang等人，2020年）。CIRI是缺血性中风的关键病理机制，导致功能性神经元的不可逆丢失和神经组织损伤（Li等人，2019a；Vongsfak等人，2021年）。目前，尚无有效的CIRI治疗方法，治疗选择有限（Sharma等人，2020年；Fan等人，2017年）。
自噬对于维持脑微环境和细胞稳态至关重要；异常的自噬会加剧神经元死亡（Wu等人，2025年）。为了减轻代谢压力并维持稳态，自噬会将细胞器、蛋白质、RNA等需要降解的细胞成分包裹进双膜囊泡中，形成自噬体。这些自噬体随后与溶酶体融合形成自溶体，在其中其内容物被降解（Hou等人，2019年）。尽管一些研究表明增强自噬对CIRI具有保护作用（Liu等人，2023年；Mu等人，2024年），但其他研究指出抑制自噬可以减轻损伤（Wang等人，2024a；Wang等人，2024b）。这种双重作用使自噬成为一个潜在但有挑战性的治疗靶点，其在CIRI中从保护性向有害性的转变的精确调控机制尚未完全阐明。
最近，由于外泌体能够通过传递生物活性分子来介导细胞间通讯，因此成为治疗神经系统疾病的很有前景的无细胞疗法（Li等人，2024年；Wang和Yang，2023年）。先前的研究表明，间充质干细胞来源的外泌体（MSC-EXOs）可以减少炎症和凋亡，并促进CIRI中的血管生成（Liu等人，2021年；Yan等人，2023年；Xiao等人，2023年）。关键的是，外泌体的治疗效果与其细胞来源密切相关，因为它们从母细胞继承了独特的分子负载和趋向性（Li等人，2020年；Xie等人，2022年）。神经干细胞（NSCs）由于其自我更新能力和分化为神经元的潜力而具有神经再生的潜力（Boese等人，2020年）。理论上，NSC来源的外泌体（NSC-EXOs）可能比MSC-EXOs具有更强的神经趋向性和携带特定的神经修复信号（Yang等人，2021年）。因此，NSC-EXOs作为新型治疗手段的潜力值得探索。值得注意的是，研究表明外泌体的生成与自噬之间存在密切的分子机制：外泌体可以调节某些与自噬相关的基因，从而影响自噬水平，表明两者之间存在关联（Zhao等人，2020年）。然而，目前关于NSC-EXOs是否以及如何调节自噬从而影响CIRI的研究仍然非常有限。
基于这一知识空白，本研究旨在探讨hNSC-EXOs在CIRI动物模型中的治疗潜力。我们鉴定了hNSC-EXOs，在大鼠tMCAO模型中评估了它们的治疗效果，并研究了它们对自噬相关蛋白和自噬体形成的影响。此外，我们进行了初步的蛋白质组学分析，以确定hNSC-EXO作用的潜在蛋白质介质。我们的发现为hNSC-EXOs作为CIRI靶向治疗载体的有效性提供了新的证据，并阐明了之前未被充分认识的自噬调控机制。
章节片段
hNSC的培养和hNSC-EXOs的提取
BV2和HT22细胞购自Procell公司（中国），并在特定的细胞培养基（Procell公司）中培养。hNSC来自上海BFB生命科学公司，通过免疫荧光染色确认了NSC特异性标记物（Nestin和Musashi1）的表达。培养基为DMEM/F12，添加了21%青霉素-链霉素（PS）溶液、B27补充剂、1%谷氨酰胺、20 ng/mL人bFGF、20 ng/mL人EGF和4 μg/mL肝素钠。
hNSCs和hNSC-EXOs的鉴定
为了研究hNSC-EXOs对CIRI损伤的影响，本研究中鉴定了hNSCs。如图1A所示，这些细胞对Musashi1和Nestin呈阳性反应，Musashi1在细胞质和细胞核中明显表达，Nestin在细胞骨架中表达（图1A）。这表明用于本研究的细胞确实是hNSCs。进一步地，使用Western blotting、TEM、SEM和NTA分离并表征了hNSC-EXOs。分离出的hNSC-EXOs表达了外泌体标记蛋白CD9。
讨论
本研究表明，PKH26标记的hNSC-EXOs被BV2和HT22细胞摄取，并主要位于脑损伤区域，其总通量具有时间依赖性。此外，静脉注射hNSC-EXOs显著缓解了大鼠的脑缺血-再灌注损伤。主要发现包括神经功能的改善、脑梗死体积和水肿的减少、神经元凋亡的减轻，以及血清细胞因子谱型的变化。
CRediT作者贡献声明
李雄：撰写——初稿、可视化、验证、项目管理、方法学、研究、数据分析、概念化。霍思颖：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。袁阳：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、方法学、研究、概念化。张琪：撰写——审阅与编辑、验证、资源管理、方法学、研究。伦理批准
本研究获得了昆明医科大学动物实验伦理委员会的批准（KMMU20220503）。
资助
中国国家自然科学基金（资助编号：81760248和81960250）。致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金的资助（资助编号：81760248和81960250）。作者还要感谢昆明医科大学（中国昆明）的技术支持。
