《Brain and Behavior》：High-mobility Group Protein 1/ Receptor for Advanced Glycation End Products/ Nuclear Factor-κB Signalling Pathway Contributes to the Pathogenic Process of Striatal Neuron Impairment in the Rat Model of Parkinson's Disease
1 引言
帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种神经系统疾病，其特征是中脑黑质多巴胺（dopamine, DA）神经元的死亡和变性，导致纹状体中多巴胺水平显著降低。尽管已有大量研究旨在阐明PD的病理生理机制，但其确切病因仍不清楚。在PD患者神经退行性变的潜在解释中，神经元死亡和慢性神经炎症已被涉及。然而，脑内慢性炎症的演变及其对PD病理生理学的具体影响仍难以确定。
晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products, RAGE）在帕金森病患者中的表达显著上调，这与神经元中的炎症、氧化应激和蛋白质聚集有关，促进了多种疾病的病理生理过程。越来越多的证据表明，RAGE在触发和维持炎症反应中起着关键作用，而炎症反应会导致神经退行性变。因此，靶向RAGE信号通路可能是治疗帕金森病的一种有效策略。作为一种免疫球蛋白超家族的35千道尔顿跨膜受体，RAGE通过与不同配体相互作用介导炎症反应，这些配体包括β-淀粉样肽（Aβ）、晚期糖基化终末产物（AGE）、S100家族蛋白和高迁移率族蛋白1（high-mobility group protein 1, HMGB1）。HMGB1是一种低分子量非组蛋白染色质蛋白，它与RAGE相互作用，从而激活促炎通路。HMGB1在多种人类疾病中扮演关键角色，例如癌症、神经退行性疾病和自身免疫性疾病。抑制HMGB1的表达和转运已被证明可以减少1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的多巴胺能神经元变性，同时降低中脑组织中的RAGE水平。此外，RAGE在配体结合后启动一系列细胞信号事件，包括促炎细胞因子的表达、炎症反应的诱导以及核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）的激活。NF-κB是一种在神经退行性过程中具有关键作用的转录因子，它调节几种重要细胞因子的表达，例如白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。值得注意的是，6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine, 6-OHDA）可诱导RAGE激活并增加其在大鼠黑质中的水平，导致下游信号通路激活并进一步诱导炎症反应。然而，HMGB1/RAGE/NF-κB信号通路在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中导致纹状体神经元损伤的具体机制仍不清楚。
为了解决这些问题，本研究利用6-OHDA诱导的多巴胺耗竭PD模型，通过行为学研究、免疫组织化学和蛋白质印迹法，研究并比较HMGB1/RAGE/NF-κB轴和纹状体神经元的特征性变化。此外，我们还检测了RAGE抑制对多巴胺耗竭后纹状体神经炎症和细胞损伤的影响，旨在揭示其潜在机制。
2 方法
2.1 动物分组与模型建立
斯普拉格-杜勒（Sprague-Dawley, SD）大鼠（8周龄，200-250克）购自中山大学实验动物中心。所有大鼠的护理和处理程序均获得暨南大学伦理委员会批准[NO.20220313-12]。本研究严格遵守《实验室动物护理和使用指南》。
50只实验大鼠被随机分为四组：（1）对照组（n = 10），不接受任何处理；（2）PD模型组（n = 10），向内侧前脑束（middle forebrain bundle, MFB）注射6-OHDA溶液；（3）RAGE抑制剂FPS-ZM1治疗组（n = 10；6-OHDA+FPS-ZM1）；（4）假手术组（n = 20），接受与其他组相同的手术程序，但注射0.9%生理盐水代替6-OHDA或FPS-ZM1。FPS-ZM1是一种高亲和力、有效的RAGE V结构域介导的配体结合的多模式阻断剂，是一种无毒、可透过血脑屏障的叔酰胺物质。建立PD模型后，6-OHDA+FPS-ZM1组每天腹腔注射FPS-ZM1（1 mg/kg/天，2 mL），持续1周。手术后四周，动物经腹腔麻醉（戊巴比妥钠，50 mg/kg, i.p.），灌注4%多聚甲醛并固定，或收集新鲜组织用于蛋白质印迹和免疫组织化学实验。
采用6-OHDA诱导的多巴胺耗竭方法建立PD模型。6-OHDA溶解于含0.01%抗坏血酸的0.9%生理盐水中，浓度为2 μg/μL。每只大鼠向右MFB注射8 μL该溶液。注射坐标如下：内侧-外侧（ML）：-0.19 mm，前-后（AP）：-3.6 mm，背-腹（DV）：-8.2 mm。进行两次4 μL的间歇性注射，间隔5分钟，留针15分钟后缓慢撤出。在6-OHDA损伤建立后的三周内，给大鼠皮下注射阿扑吗啡（0.25 mg/kg），并在30分钟内计数对侧360°旋转的次数。仅总旋转数超过210次的大鼠被纳入进一步分析。采用酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）免疫组织化学染色验证模型是否成功。后续实验仅在对侧纹状体半球TH纤维损失超过95%的大鼠上进行。
2.2 行为学测试
2.2.1 抓力测试（Grip Strength Test, GST）
手术后4周进行GST。将一根直径2毫米、长35厘米的金属丝悬于地面50厘米高处，记录大鼠抓握金属丝的时间。每天测试3次，共测试5天。所有动物均参与测试（n = 10/组）。观察者对大鼠的实验条件不知情。
2.2.2 莫里斯水迷宫任务（Morris Water Maze Task）
6-OHDA注射后5周进行该实验。大鼠首先接受训练，每天两次，连续五天。在训练的最后一天进行探测试验。目标平台（直径10厘米）固定放置。每次实验从四个预定起始点（东、南、西、北）释放动物，让其游泳最多2分钟或直至找到平台。如果大鼠成功找到并爬上平台，让其停留30秒以帮助记忆位置。如果大鼠在2分钟内未找到平台，则手动将其移至平台并停留30秒。使用TopScan行为分析系统记录潜伏期。
2.3 免疫组织化学与免疫荧光
遵循标准化实验室方案进行免疫染色。所有大鼠在6-OHDA损伤后4周，先用苯巴比妥钠（50 mg/kg, i.p.）麻醉，然后经心脏灌注PBS和4%多聚甲醛。取出脑组织并在4%多聚甲醛中4℃固定过夜。用振动切片机切割30 μm厚的脑片。切片在约耳间平面水平（10.70 mm 至 8.74 mm）收集。切片用0.1% Triton-X-100和0.3% H2O2预处理30分钟后，在室温下用3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）封闭非特异性结合位点0.5小时。然后将切片与稀释于缓冲液（0.5% BSA + 0.3% Triton in PB）中的一抗在4℃下孵育24小时。使用的一抗包括：小鼠抗TH（1:1000）、兔抗HMGB1（1:1000）、兔抗RAGE（1:400）、兔抗NF-κB（1:200）。冲洗后，切片在室温下与稀释的二抗（抗兔IgG或抗小鼠IgG，1:200）孵育3小时，然后与同源的PAP复合物（1:200）在室温下孵育2小时。过氧化物酶反应使用0.05%的3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine, DAB）在0.1 M PBS（pH 7.4）中进行，室温反应1-2分钟。切片裱于明胶包被的载玻片上，脱水、透明，中性树胶封片。
对于免疫荧光，采用常规双标免疫荧光方法。一抗稀释于含0.3% Triton X-100和0.5% BSA的0.1 M PBS中。使用的一抗包括：小鼠抗NeuN（1:800）、兔抗HMGB1（1:1000）、兔抗RAGE（1:400）、兔抗NF-κB（1:200）。切片与一抗4℃孵育过夜后，与荧光标记的二抗（抗兔或抗小鼠，1:200）孵育。最后，脑切片用含DAPI的封片剂封片，在尼康C2显微镜下采集图像。
2.4 蛋白质印迹法（Western Blotting）
6-OHDA损伤后4周，大鼠用戊巴比妥钠（50 mg/kg, i.p.）深度麻醉。提取纹状体组织并用RIPA裂解液裂解。蛋白样品（30 μL）经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride, PVDF）膜。膜用含5%脱脂牛奶的Tris缓冲盐水和Tween20（TBST）封闭2小时，然后与一抗4℃摇床孵育过夜。使用的一抗包括：兔抗HMGB1（1:1000）、兔抗RAGE（1:1000）、兔抗NF-κB（1:3000）、兔抗β-肌动蛋白（β-actin, 1:2000）。随后，膜与辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的二抗（山羊抗兔IgG，1:5000；山羊抗小鼠IgG，1:5000）在室温下孵育2小时。使用Bio-Rad系统显影蛋白条带，ImageJ v1.8.0软件进行定量分析。
2.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）
6-OHDA损伤后4周，大鼠用戊巴比妥钠（50 mg/kg, i.p.）深度麻醉后处死。取出每只大鼠的纹状体。使用TRIzol试剂提取总RNA。用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒合成cDNA。样品在PCR仪上42℃孵育60分钟以灭活逆转录酶。在ABI PRISM 7000序列检测系统上，使用SYBR-Green Master Mix进行qPCR。反应条件：50℃ 5分钟，95℃ 10分钟；然后95℃ 30秒，60℃ 30秒，共45个循环。采用2-ΔΔCq法计算基因相对表达量。使用的引物序列如下：HMGB1上游：5′-AAAGGAGATCCTAAGAAGCCGA-3′；下游：5′-TCATAACGAGCCTTGTCAGCC-3′。RAGE上游：5′-TGAGACGGGACTCTTCACGCT-3′；下游：5′-CACCTTCAGGCTCAACCAACA-3′。NF-κB上游：5′-GCTCCTTTTCTCAAGCCGATGT-3′；下游：5′-CGTAGGTCCTTTTGCGTTTTTC-3′。β-actin上游：5′-GAACCCTAAGGCCAAC-3′；下游：5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′。使用7500系统SDS软件v.2.0.6分析熔解曲线。
2.6 数据收集与统计分析
根据Paxinos和Watson图谱，大约获取耳间平面（8.74 mm–10.70 mm）的切片。帕金森病的运动症状与背外侧纹状体密切相关。在纹状体的每个水平，相邻切片分别进行HMGB1、RAGE和NF-κB免疫染色。光镜观察显示，纹状体中的HMGB1、RAGE和NF-κB阳性神经元均匀分布。研究人员对不同实验类型不知情。使用上述技术计数神经元密度。在随机选择的5个边长为100 μm的方格中，计数HMGB1、RAGE和NF-κB阳性神经元。每组每只大鼠选择5个脑切片进行免疫组织化学染色和后续统计分析。
所有数据使用SPSS 20.0进行统计分析。实验结果以均值±标准差（x? ± s）表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-way analysis of variance, ANOVA），两组间比较采用独立样本t检验。三组间的统计学显著性使用最小显著差异法（least significant difference, LSD）进行事后检验。P值小于0.05认为差异具有统计学意义。
3 结果
统计学分析显示PD模型组与假手术组之间无显著差异。因此，除非另有说明，后续实验仅显示对照组、6-OHDA组和6-OHDA+FPS-ZM1组。
3.1 RAGE抑制剂FPS-ZM1治疗改善了PD模型大鼠的行为障碍
我们实验室先前的研究证实，6-OHDA诱导的多巴胺耗竭会导致实验大鼠出现急性行为缺陷。根据时间线评估小鼠的抓力以及学习和记忆能力，6-OHDA被准确注射到MFB。PD组的TH染色结果显示阴性（颜色较浅），而对照组TH染色颜色较深。抓力测试结果显示，6-OHDA组PD模型大鼠的悬挂时间（21.98 ± 1.51秒）明显长于对照组大鼠（11.56 ± 1.40秒，P < 0.05）。此外，在莫里斯水迷宫测试中，6-OHDA组（109.5 ± 8.41秒）的潜伏期时间与对照组（47.00 ± 19.75秒；P < 0.05）相比显著增加。给予RAGE抑制剂FPS-ZM1后，大鼠的悬挂时间（18.60 ± 1.44秒；P < 0.05）明显短于6-OHDA组动物。此外，FPS-ZM1组大鼠的潜伏期（55.78 ± 17.23秒；P < 0.05）短于6-OHDA组大鼠。
3.2 FPS-ZM1降低了纹状体中HMGB1阳性神经元的密度
在正常和病理情况下，HMGB1作为RAGE的配体起着关键的调节作用。对照组显示出更明显的HMGB1免疫反应，阳性细胞均匀分布在纹状体中，呈球形颗粒状。6-OHDA组的阳性细胞密度（19.20 ± 1.96）显著高于对照组（9.20 ± 1.39；p < 0.05）。然而，6-OHDA + FPS-ZM1组的HMGB1阳性颗粒密度（10.40 ± 1.03）明显低于6-OHDA组（19.20 ± 1.96；p < 0.05）。双标染色证实这些HMGB1阳性结构主要位于NeuN阳性神经元的细胞核内。6-OHDA组的双标细胞数量（15.40 ± 0.68）显著高于对照组（8.40 ± 1.03, p < 0.05）。此外，与6-OHDA组（15.40 ± 0.68, p < 0.05）相比，6-OHDA+FPS-ZM1组的双标细胞数量（10.40 ± 0.93）减少。
3.3 FPS-ZM1部分抑制了多巴胺耗竭诱导的RAGE反应
研究发现，正常大鼠纹状体中存在大量均匀分布的RAGE阳性细胞（17.60 ± 0.68），但此数量低于6-OHDA组（22.00 ± 0.84, P < 0.05）。相比之下，6-OHDA+FPS-ZM1组显示的RAGE阳性细胞数量（17.60 ± 0.51, P < 0.05）明显较低。采用免疫荧光双标染色确认RAGE和NeuN的共定位。结果显示，6-OHDA组中的双标细胞数量（17.40 ± 0.93）显著高于对照组（11.40 ± 1.50, P < 0.05）。此外，给予FPS-ZM1后，与6-OHDA组相比，双标细胞数量显著减少（11.60 ± 1.29, P < 0.05）。
3.4 抑制RAGE降低了多巴胺耗竭纹状体中NF-κB的表达
分子生物学研究已证实RAGE是NF-κB的上游蛋白，并通过多种蛋白激酶调节NF-κB的蛋白水平和功能。在对照组纹状体（3.40 ± 0.71）中，免疫组织化学染色仅发现少量NF-κB阳性细胞，而6-OHDA诱导的纹状体多巴胺耗竭使NF-κB阳性细胞数量（14.65 ± 0.68；P < 0.05）与对照组相比急剧增加。用FPS-ZM1治疗后，NF-κB阳性细胞数量（6.43 ± 0.55；p < 0.05）与6-OHDA组相比显著减少。免疫荧光双标显示NF-κB和NeuN的共定位，6-OHDA组（10.50 ± 0.37）的双标细胞数量显著多于对照组（2.47 ± 0.25；p < 0.05）。大约20%的NF-κB阳性细胞在6-OHDA组中未显示与NeuN的双标。与6-OHDA组相比，6-OHDA+FPS-ZM1组的双标细胞数量（5.15 ± 0.32；p < 0.05）显著减少。
3.5 FPS-ZM1下调了多巴胺耗竭诱导的纹状体HMGB1、RAGE、NF-κB蛋白及mRNA水平
基于上述免疫组织化学检测结果，采用蛋白质印迹法进一步研究纹状体多巴胺耗竭诱导的HMGB1、RAGE和NF-κB蛋白水平的变化，以及FPS-ZM1对这些变化的影响。在对照纹状体中，HMGB1（0.79 ± 0.04）、RAGE（0.88 ± 0.11）和NF-κB（0.88 ± 0.10）均有表达。6-OHDA诱导多巴胺耗竭后，纹状体中HMGB1（1.22 ± 0.13；p < 0.05）、RAGE（1.27 ± 0.10；p < 0.05）和NF-κB（1.40 ± 0.16；p < 0.05）的水平显著升高。多巴胺耗竭后注射FPS-ZM1显著降低了HMGB1（0.88 ± 0.04；p < 0.05）、RAGE（0.93 ± 0.11；p < 0.05）和NF-κB（0.95 ± 0.06；p < 0.05）蛋白水平。
采用RT-qPCR探讨纹状体多巴胺耗竭诱导的HMGB1、RAGE和NF-κBmRNA水平的变化以及FPS-ZM1对这些变化的影响。结果显示，对照组（1.102 ± 0.05）的HMGB1表达水平与6-OHDA组（1.054 ± 0.02）或6-OHDA+FPS-ZM1组（1.096 ± 0.03；p > 0.05）无显著差异。然而，RT-qPCR分析表明，与对照组（0.96 ± 0.03；0.91 ± 0.05；p < 0.05）相比，6-OHDA组中RAGE和NF-κB的表达水平上调（分别为1.24 ± 0.05；1.39 ± 0.05）。同样，与6-OHDA组（1.24 ± 0.05；1.39 ± 0.05；p < 0.05）相比，6-OHDA+FPS-ZM1组中RAGE和NF-κB的表达水平（1.02 ± 0.03；0.97 ± 0.07）较低。
4 讨论
我们利用6-OHDA诱导的黑质纹状体变性大鼠模型，研究抑制RAGE活性是否能改善运动协调性并减轻背外侧纹状体神经元的损伤。6-OHDA诱导多巴胺耗竭后，背外侧纹状体的RAGE阳性细胞数量和RAGEmRNA表达水平均显著高于对照组，表明RAGE参与PD的发生和发展。然而，用RAGE抑制剂FPS-ZM1治疗的6-OHDA+FPS-ZM1组大鼠，与6-OHDA组相比，表现出运动协调性改善和纹状体神经元功能保留。蛋白质印迹分析结果证实了早期实验的发现，显示6-OHDA诱导的PD组中HMGB1、RAGE和NF-κB蛋白水平显著高于对照组和FPS-ZM1治疗组。因此，本研究证实RAGE可能通过特定机制在纹状体神经元损伤和PD的发病机制中起关键作用。
PD的发病机制涉及神经元细胞的各种潜在反应，包括炎症、凋亡和自噬；然而，其确切机制仍不清楚。已确定RAGE在PD的退行性过程中起关键作用。RAGE与多种配体相互作用，介导不同细胞类型的多种生物活动，如促炎通路、免疫反应、氧化应激和细胞迁移。RAGE表达和激活的异常增加，以及随后的免疫反应，被认为在几种人类疾病的致病过程中起作用，包括像PD这样的神经退行性疾病。临床研究报告称，与健康个体相比，PD患者额叶皮层中的RAGE水平显著更高。在MPTP诱导的小鼠PD模型中，RAGE的缺失有效减弱了MPTP诱导的细胞毒性，并减少了RAGE介导的炎症反应，从而延迟了PD的发生。
RAGE与许多配体相互作用，并且在帕金森病的退行性阶段很重要。HMGB1是一个关键的RAGE配体。本实验中，6-OHDA组的背外侧纹状体显示出明显多于正常对照组的HMGB1阳性细胞和HMGB1蛋白，证明了HMGB1参与6-OHDA诱导的黑质纹状体变性的病理过程。先前的实验表明，当给PD模型大鼠注射单克隆抗体抑制HMGB1时，6-OHDA的神经毒性会降低。以往的文献已经建立了RAGE与HMGB1在多种神经退行性疾病中关联的联系。此外，与6-OHDA组相比，由于RAGE活性降低，背外侧纹状体表现出HMGB1阳性细胞数量和HMGB1蛋白水平减少。组蛋白通常与HMGB1一起存在于细胞核中，在特定的病理条件下可以释放到细胞质中，促进各种疾病过程。先前的研究表明，在MPTP诱导的帕金森病动物模型以及广泛使用的PD模型药物鱼藤酮引起的细胞周期停滞中，HMGB1从细胞核转移到细胞质。我们将在进一步的研究中确认这种现象是否发生在6-OHDA诱导的SD大鼠PD模型中。因此，尽管HMGB1的mRNA水平没有变化，但其蛋白水平可能主要从细胞核转移到细胞质和细胞外空间。这表明HMGB1和RAGE的相互作用可能参与了6-OHDA引起的PD的病理生理学。
RAGE与其配体HMGB1的结合诱导细胞内信号转导。根据本研究的结果，在6-OHDA诱导多巴胺耗竭后，纹状体神经元中的NF-κB表达升高。RAGE激活通过RAGE信号转导依赖性机制触发活性氧（reactive oxygen species, ROS）的快速产生并增强炎症通路的活性，最终导致NF-κB激活。NF-κB调节多种重要细胞因子的表达，包括TNF-α、IL-1β和IL-6。这些细胞因子参与神经退行性变的发展。此外，这些可溶性细胞因子及其受体不仅吸引和激活神经胶质细胞，还触发信号通路，在正反馈循环中导致几种促炎介质的产生。然而，驱动促炎微环境的建立和维持以及随后细胞损伤的确切分子机制尚不完全清楚。在本研究中，抑制6-OHDA诱导多巴胺耗竭大鼠的RAGE活性后，大鼠纹状体神经元中的NF-κB表达下调。这表明NF-κB参与了RAGE和6-OHDA诱导的多巴胺耗竭导致神经元损伤的机制。最近的报告表明，RAGE通过调节自噬、炎症和凋亡来促进细胞损伤。然而，应承认某些局限性。
然而，我们未设置单独使用FPS-ZM1治疗的对照组。虽然这限制了我们就抑制剂本身任何基线效应得出明确结论的能力，但需要指出的是，先前研究已对FPS-ZM1进行了广泛表征，在所用剂量下无明显脱靶效应或毒性，且不影响大鼠的正常运动或认知表现；即使给予500倍治疗剂量也不会引起任何显著毒性。此外，关于HMGB1，虽然我们的mRNA数据显示没有变化，但蛋白水平和免疫组织化学信号的显著增加强烈提示存在翻译后调控和易位，这是在其它PD模型中有充分记载的现象。此处涉及的具体机制是我们目前探索的方向。因此，配体相互作用后，RAGE激活的细胞内机制导致细胞质中NF-κB复合物的p65和p50亚基与抑制性NF-κB抑制剂（inhibitor of NF-κB, IκB）亚基解离，导致p65核转位。未来，研究RAGE抑制对p65和IκB的影响具有重要意义。
5 结论
本研究在PD大鼠模型中研究并比较了RAGE抑制对多巴胺耗竭后纹状体中HMGB1、RAGE和NF-κB的影响。研究结果表明，除了传统上认识的中脑黑质之外，针对HMGB1/RAGE/NF-κB通路理解纹状体神经元的损伤机制和保护，可能为PD的基础研究和临床治疗提供新的靶点。
