构建厌氧微环境：氢化酶催化氢疗法促进糖尿病伤口愈合的生物工程策略

《Aggregate》：Engineering an Anaerobic Microenvironment to Empower Hydrogenase-Catalyzed Hydrogen Therapy for Diabetic Wound Healing

本文报道了一种创新型肽-纳米簇杂化水凝胶，通过构建自维持厌氧微环境，成功解决了氢化酶（hydrogenase）的氧敏感性问题，实现了有氧条件下的酶催化氢治疗。该体系利用Fmoc-KYF肽网络捕获O2于疏水口袋，光激发银纳米簇（AgNCs）快速清除残余氧，确保稳定产氢。在糖尿病小鼠模型中，光激活系统显著加速伤口愈合，促进血管新生并驱动巨噬细胞向修复表型极化。这项研究为克服氧限制难题、推进氢化酶生物医学应用提供了创新性解决方案。

　　

工程化构建厌氧微环境实现氢化酶催化氢治疗

研究背景与挑战

氢化酶是一类广泛存在于微生物中的金属酶，能够可逆催化质子与分子氢的转化（2H⁺+ 2e^?? H₂），具有媲美铂催化剂的高效催化性能。然而其固有的氧敏感性严重限制了其在生物医学领域的应用。现有增强氢化酶氧耐受性的策略主要分为生物工程改造和材料辅助两类，但往往依赖有毒电子介质（如甲基紫精MV），难以适用于生物体内环境。

保护性水凝胶基质的设计与表征

研究团队设计了一种新型杂化肽-纳米簇水凝胶系统，通过Fmoc-KYF三肽自组装形成纳米纤维网络。该肽序列通过引入酪氨酸（Y）调节疏水性，并利用赖氨酸（K）提供与带负电银纳米簇（AgNCs）的静电相互作用点。圆二色谱分析显示肽链呈现β-折叠构象，加入AgNCs后转变为α-螺旋结构。流变学测试证实水凝胶具有优异的机械性能（储能模量G′≈1100 Pa），适合作为创面敷料应用。

有氧条件下光催化产氢性能验证

通过蛋白质膜电化学分析证实，水凝胶包裹的氢化酶（3S1C-Hyd-2变体）在有氧条件下能保持显著更高的催化活性。在优化条件（0.25 nmol 3S1C-Hyd-2, 5 mg mL^?1Fmoc-KYF, 0.5 mg mL^?1AgNCs, pH 7.0）下，连续光照48小时仍能维持50%以上活性（I₅₀=32 h），而游离酶组装体在空气中15分钟内活性丧失超过95%。

厌氧微环境形成机制解析

透射电镜和原子力显微镜显示水凝胶形成直径10-50 nm的纤维网络结构，AgNCs以5-10 nm颗粒分布于肽纤维上。甲基紫精褪色实验证明水凝胶三维结构能显著限制氧气扩散（48小时后仍保留60% MV^+?颜色强度）。分子动力学模拟揭示Fmoc基团、酪氨酸环、苯丙氨酸环与水分子的氢键网络共同构成疏水口袋，选择性限制O₂扩散而不阻碍H₂透过。

光诱导化学除氧机制

AgNCs的LUMO能级（-0.55 V vs. NHE）满足O₂/·O₂^?（-0.33 V）和O₂/H₂O₂（0.28 V）的热力学要求。DCFDA荧光检测证实光照下AgNCs能产生活性氧，而加入氢化酶或饱和氢溶液后荧光显著降低，表明生成的氢气参与氧清除过程，形成"光触发点燃"机制。

ROS清除与抗炎效应

在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型中，3S1C-Hyd-2组装体处理显著降低细胞内ROS水平。实时定量PCR显示促炎因子基因（Tnfα、Il1b、Il18、Il6）表达下调，抗凋亡标记Bcl2表达上调。RNA测序进一步证实处理组中TLR4、NF-κB、NLRP3炎症通路相关基因下调，同时抗炎和抗凋亡基因表达增强。

糖尿病伤口愈合促进效果

在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中，水凝胶敷料治疗显著加速伤口闭合（第7天达70%，第11天达87%）。组织学分析显示治疗组肉芽组织更厚，上皮化更完整，Masson染色显示胶原纤维排列更致密。免疫荧光证实治疗组ROS积累减少，CD206⁺M2型巨噬细胞比例增加，α-SMA⁺血管密度显著提高。

转录组学机制深入解析

伤口组织RNA测序发现，治疗组在第7天呈现最显著的基因表达变化，2378个基因上调，2786个基因下调。下调基因富集于ROS代谢、免疫应答和炎症通路，上调基因则涉及表皮发育和角质形成细胞分化等组织修复过程。基因集富集分析证实"皮肤表皮发育"和"角质形成细胞分化"通路激活，Krt1、Krt2、Krt5等角蛋白基因显著上调。

这项研究通过巧妙的材料设计、酶催化与光动力学整合，成功构建了能克服氧限制的氢化酶治疗平台，为慢性伤口治疗及其他氧敏感生物催化剂的生物医学应用开辟了新途径。