三维细胞球模型在纳米毒理学评估中的新方法：纳米结构碳化羟基磷灰石对脂肪干细胞球体的比较细胞毒性分析

《JOURNAL OF APPLIED TOXICOLOGY》：New Approach Methodologies (NAMs) in Alternative Methods: A Comparative Cytotoxicity Analysis of Nanostructured Hydroxyapatite in Adipose Stem Cells Spheroids

本文系统比较了2D单层与3D球体培养模型在评估纳米结构碳化羟基磷灰石（nCHA）生物相容性中的差异。研究发现ATP定量法能可靠评估3D球体活力，且球体对SDS的敏感性比单层高8倍（IC50=9.67 μg/mL）。nCHA主要定位于球体胞外基质胶原纤维周围，未引起细胞毒性或形态改变，为骨组织工程中球体功能化提供了新思路。

　　

摘要

本研究通过比较二维（2D）单层和三维（3D）球体培养模型，评估了纳米结构碳化羟基磷灰石（nCHA）在脂肪干细胞（ASC）中的细胞毒性。基于OECD指南，采用中性红摄取（NRU）和ATP定量法进行检测。结果显示nCHA在单层和球体模型中均无细胞毒性，而球体对SDS的敏感性显著高于单层（IC₅₀分别为9.67 μg/mL和76 μg/mL）。透射电镜显示nCHA主要分布于球体胞外基质的胶原纤维附近。研究表明3D球体可作为纳米毒理学评估的新方法（NAM），且nCHA功能化的ASC球体在骨再生中具有应用潜力。

引言

球体模型在组织工程中作为无支架构建单元广泛应用，其与纳米颗粒结合可增强分化潜能和分泌功能。然而，纳米材料可能通过影响球体内部营养渗透导致坏死核心形成。羟基磷灰石（HA）纳米颗粒可被细胞内化，调控成骨分化，但其在功能化球体中的毒性尚未系统评估。本研究首次基于OECD指南，对比nCHA在ASC单层与球体中的毒性，并探索其作为骨组织工程模型的可行性。

材料与方法

人ASC从健康捐赠者分离培养，单层模型采用96孔板接种2×10⁴细胞，球体模型通过微模胶模具形成含1×10⁶细胞的球体。通过湿法沉淀合成含0.8 wt% CO₃的nCHA，并通过XRD、FTIR和BET表征其理化性质。细胞分别暴露于nCHA（0.01–100 μg/mL）和SDS（6.8–100 μg/mL）48小时，通过NRU（OECD TG 432）和ATP定量法（CellTiter-Glo 2.0/3D）评估活力。球体直径和球形度通过光学显微镜分析，nCHA定位通过透射电镜（TEM）观察。

结果

nCHA表征

XRD显示nCHA为低结晶度碳酸化HA，FTIR在420–550 cm^?1确认CO₃^2?取代磷酸基团，BET表面积为72 m²/g。

单层模型毒性评估

NRU法在100 μg/mL nCHA组出现吸光度异常升高，而ATP法定量显示nCHA无毒性。SDS在单层中的IC₅₀为76 μg/mL（ATP法）和77 μg/mL（NRU法）。

球体模型毒性评估

ATP法定量显示nCHA无毒性，SDS在球体中的IC₅₀为9.67 μg/mL，敏感性为单层的8倍。球体在SDS作用下出现浓度依赖性解聚。

球体形态与nCHA定位

nCHA处理未改变球体直径和球形度。TEM显示nCHA主要分布于球体胞外基质胶原纤维周围，未见细胞内累积。

讨论

3D球体通过模拟体内微环境，在毒性评估中展现更高敏感性。ATP法克服了染料渗透问题，适用于球体活力检测。nCHA的胞外基质定位可能模拟骨矿物沉积过程，为功能化球体在骨工程中的应用提供基础。研究局限性包括单一样本来源和短期毒性评估，未来需扩展多样本和长期实验。

结论

ASC球体模型可作为纳米毒理学评估的可靠NAM，nCHA功能化球体在骨组织工程中具有转化潜力。