《Microchemical Journal》：Lab-on-Chip device based on aptamers for real-time zinc ion detection: Advancing on-site environmental monitoring
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Lab-on-Chip锌离子检测系统开发及性能验证
弗朗切斯卡·科斯坦蒂尼（Francesca Costantini）|里卡多·萨尔维奥（Riccardo Salvio）|尼古拉·洛韦基奥（Nicola Lovecchio）|马西莫·雷韦贝里（Massimo Reverberi）|玛蒂娜·巴尔迪尼（Martina Baldini）|奥古斯托·纳斯凯蒂（Augusto Nascetti）|加布里埃莱·法韦罗（Gabriele Favero）|多梅尼科·卡普托（Domenico Caputo）|切萨雷·马内蒂（Cesare Manetti）
农业研究与经济委员会，植物保护与认证研究中心（CREA-DC），意大利罗马C.G. Bertero路22号，邮编00156
摘要
背景
虽然低水平的锌通常是无害的，但高浓度的锌会导致严重的污染，因此对其监测对于环境和健康应用至关重要。传统的锌检测方法往往依赖于庞大且复杂的设备，这使得现场分析变得不切实际。开发一种用于锌检测的芯片实验室设备（Lab-on-Chip）具有在现场进行分析的优势，能够实现锌含量的实时监测。这种能力有助于及时采取干预措施，并可能降低成本。
结果
在这项研究中，首先使用发射光谱法对一种对锌离子具有高亲和力的适配体（aptamer）进行了表征，并采用了两种不同的荧光检测策略。基于这些发现，将这种适配体固定在微流控通道内，并与非晶硅光传感器（a-Si:H）阵列集成以实现荧光检测。这种先进的设置能够实现芯片上的荧光信号检测，这些荧光信号源于锌离子与适配体之间的相互作用。
意义
对该芯片实验室设备进行了系统的评估，特别关注了其检测限和整体性能，并将其与传统的实验室规模方法进行了对比，以突出其有效性和在实际应用中的潜力。
引言
锌是人体健康必需的微量元素，对多种生物功能至关重要，包括酶活性和免疫系统的支持。然而，饮用水中过量的锌会导致人类健康问题，而水体中高浓度的锌会破坏生态系统，危害海洋野生动物、无脊椎动物和植物[2]。锌还可能从受污染的水中积累到土壤中[3]。
尽管地表水和地下水中的锌含量通常不超过0.01毫克/升和0.05毫克/升，但由于管道中锌的溶解，自来水中的锌含量可能会高得多。环境水体中的锌污染可能来源于多种来源，如矿山排水、工业废水、镀锌钢管（家庭自来水中锌的常见来源）[4]以及农业活动[5]等。锌含量的升高可能表明镀锌管道已经腐蚀，这还可能导致其他有害金属（如镉）的释放[6]。
多个组织制定了定义Zn2+最大允许浓度的环境标准。例如，世界卫生组织（WHO）对饮用水的标准值为3毫克/升（46微摩尔/升）[4]。美国环境保护署（EPA）的标准更为严格（120微克/升；1.8微摩尔/升的Zn2+）[4]。定期监测和检测锌含量有助于确保符合这些标准，从而保护公众健康和环境。使用或生产锌的工业需要监测其废水，以防止水源受到污染。在这种情况下，准确的检测有助于遵守环境法规并避免处罚。因此，检测锌的含量可以提示需要进行基础设施维护或更换。了解锌的含量对于水处理设施有效调整其工艺至关重要，以确保水的安全饮用和使用[2]。总体而言，监测水中的锌含量是维护水质、保护健康、保护生态系统以及确保合规性的重要方面。
常见的检测方法包括原子吸收光谱法（AAS）和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）[5]、[6]。也有基于荧光检测的检测方法被报道[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。
在这种背景下，开发一种用于锌检测的芯片实验室设备（Lab-on-Chip，简称LoC）将实现现场分析，包括锌含量的实时监测，从而便于及时采取行动并降低成本。近年来，基于微流控技术的LoC技术在各个领域（包括临床诊断、环境监测和食品链安全）中已被证明非常有效[14]、[15]、[16]、[17]、[18]。LoC设备的主要优势在于其小型化，这允许使用少量样本，减少空间需求，并最小化废物产生[1]。
将光传感器[19]、[20]或电极[21]、[22]等检测单元集成到微流控平台上，可以制造出便携式、自动化的设备，可以直接在现场使用。此外，微流控通道的小尺寸显著缩短了分子的扩散时间，与标准试管相比，这加快了分析物向生物识别元件的传输速度，从而提高了响应时间，在某些情况下还提高了灵敏度[23]。此外，这些设备的小尺寸便于制造通道阵列，能够同时进行多项分析，从而提高了通量效率[23]。
已有报道指出，在基于LoC的微流控设备中使用适配体传感技术来检测不同的目标[24]、[25]。适配体常被用作抗体的替代品，其主要优点在于它们能够结合低分子量的物质（如重金属[26]），并且由于其多核苷酸结构，在恶劣条件（如低pH值、高温或长时间使用）下不易发生不可逆变性[26]。
在这项工作中，我们研究了将固定化的适配体应用于微流控芯片实验室（LoC）系统，以选择性检测锌离子。虽然已有报道基于溶液中复合物形成的锌传感器[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[13]，但只有少数被设计为便携式检测系统[4]、[27]，而LoC技术的应用尚未得到充分探索。
如上所述，选择适配体主要是因为它们易于进行化学修饰，这使得它们可以固定在微流控通道的内表面上而不影响其结合亲和力。文献中已有报道显示某些适配体对锌离子具有特异性[11]、[12]。
在这里，我们使用聚（2-羟基乙基甲基丙烯酸酯）（PHEMA）聚合物刷对微流控通道阵列进行了功能化处理，随后通过化学修饰使其能够固定Zn-6 m2适配体。该微流控系统与非晶硅光传感器阵列光学集成，以检测和量化锌离子与适配体相互作用产生的荧光信号。首先使用先前报道的aptabeacon检测方法[12]、[27]（包括一种改良的标记淬灭剂）以及一种新的基于Zn-6 m2荧光嵌入染料的检测方法[27]，重点评估了Zn-6 m2适配体的行为，以确定检测限（LoD）。比较了芯片上和溶液中进行的检测方法的灵敏度，证实了芯片实验室方法的可靠性和便利性。
材料
我们项目中使用的试剂均从默克集团（Merck group）购买。2-羟基乙基甲基丙烯酸酯（HEMA）纯度≥99%，按原样使用。2-溴-2-甲基丙酸3-三氯硅烷丙基酯（BMPTS）按照已报道的程序合成[18]。丙酮和96%乙醇（分析纯）未经进一步纯化直接使用，而甲苯则通过蒸馏提纯。压敏胶粘剂（ARCare、ARClad IS-7876和ARFlow）从Adhesive Research公司购买
溶液中适配体检测方法的表征
为了确定使用LoC设备检测和定量锌离子最有效的方法，我们测试了两种基于先前筛选出的对锌具有亲和力的适配体序列的不同类型的检测方法[12]。具体来说，这些方法是基于先前aptabeacon系统[12]的改进版本（图1a），以及一种新的基于无标记序列的aptasensor检测方法（见表1），该方法在光开关荧光团的存在下进行（图1b）。所选的无标记适配体序列采用了...
结论
本研究旨在确定使用LoC设备检测和定量锌离子最有效的方法。我们使用分光荧光计评估了两种不同的检测方法：aptabeacon系统和一种新的aptasensor检测方法。aptabeacon系统通过适配体结合时的荧光发射变化展示了检测锌离子的能力。然而，该方法表现出非线性行为，并且...
CRediT作者贡献声明
弗朗切斯卡·科斯坦蒂尼（Francesca Costantini）：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、软件开发、方法学研究、数据分析、概念化。里卡多·萨尔维奥（Riccardo Salvio）：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、软件开发、方法学研究、数据分析、概念化。尼古拉·洛韦基奥（Nicola Lovecchio）：撰写——审阅与编辑、可视化、软件开发、方法学研究、数据分析、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
致谢
本研究由Agritech国家研究中心资助，并获得了欧盟下一代研究计划（Next-Generation EU，项目名称：PNRR – MISSIONE 4 COMPONENTE 2，投资编号1.4 – D.D. 1032 17/06/2022，CN00000022）的资助。
