一种一步式、无需提取的RPA-CRISPR/EsCas13d平台，可实现PCV2的快速、灵敏且可视化的检测

《Microchemical Journal》：A one-step, extraction-free RPA-CRISPR/EsCas13d platform for rapid, sensitive and visual detection of PCV2

SHIELD平台通过整合RPA扩增、T7转录和Cas13d检测实现单管一步法病毒诊断，无需核酸提取且可在30分钟内完成，适用于资源有限环境。

　　

Jia-qi Duan|Yang-ming Dai|Tong Xu|Yuan-meng Wang|Lei Zhao|Dong You|Fang Wu|Si-Yuan Lai|Yi Qing|Liang-Peng Ge|Zuo-Hua Liu|Jing Sun|Xiu Zeng|Ling Zhu|Zhi-wen Xu

四川农业大学兽医学院，中国成都611130

摘要

人类和动物的传染病爆发持续给全球健康和经济带来巨大负担，这凸显了开发创新诊断技术以控制传播的迫切需求。在这项研究中，我们介绍了SHIELD（Streamlined Hazard Identification for Epidemic Limitation and Defense）平台，这是一种无需提取样本的RPA-CRISPR/EsCas13d技术，能够在资源有限的环境中实现快速、准确的检测。我们优化了检测流程，使RPA、T7转录和CRISPR/EsCas13d切割能够在同一管中进行，从而简化了工作流程并将总检测时间缩短至30分钟。快速核酸释放技术消除了对实验室提取和复杂加热程序的需求，进一步提高了SHIELD的操作简便性。SHIELD可以在体温（37°C）和室温（25°C）下运行，这是迈向无需恒温器设备的重要一步。使用改良的冻干试剂减少了冷链要求，简化了检测准备过程，使其便于低成本运输和现场应用。SHIELD能够灵敏地检测猪圆环病毒2型（PCV2），并提供两种可视化读数模式——470纳米紫外光和侧向流动分析（LFA），便于在不同环境中灵活解读检测结果。我们使用62个临床样本验证了SHIELD的准确性，其灵敏度和特异性均达到定量聚合酶链反应（qPCR）的水平，证明了其作为即时检测和现场应用的强大诊断工具的潜力。

引言

近年来，人类和动物中的传染病爆发——如SARS-CoV-2、寨卡病毒（ZIKV）、猴痘（MPXV）和猪圆环病毒2型（PCV2）——给全球健康和经济带来了重大影响[1]、[2]、[3]。传统的病原体核酸检测通常需要将样本运输到中心实验室进行处理和分析。qPCR被公认为当前病毒检测的金标准，具有高灵敏度和特异性[4]、[5]。然而，它受到集中采样、较长检测时间和依赖实验室基础设施的限制。即时检测（POCT）在应对这些挑战方面发挥着关键作用。通过使用等温扩增技术（如环介导等温扩增（LAMP）[6]和重组酶聚合酶扩增（RPA）[7]、[8]、[9]、[10]，可以规避对热循环仪的依赖。然而，RPA存在气溶胶污染的风险，而LAMP检测的灵敏度有限[11]。因此，需要在等温扩增方法上进行进一步创新，以实现低成本、高通量的现场检测。

最近，基于CRISPR/Cas的诊断平台（CRISPR-Dx）作为一种极具前景的POCT工具出现，具有快速检测、高特异性和简单反应条件等优点[12]、[13]、[14]。尽管CRISPR诊断与等温扩增的结合可以克服各自的局限性，但往往会增加操作复杂性[15]、[16]。SHERLOCK和DETECTR[17]、[18]这两种两步CRISPR诊断方法分别依次进行等温扩增和CRISPR检测，导致检测时间延长、工作流程复杂化以及气溶胶污染风险增加[19]、[20]。为了解决这些问题，开发了单步平台如SCOPE[21]和HOLMESv2[22]。然而，尽管这些方法具有潜力，但它们通常侧重于设备创新，且获取核酸的过程仍需要加热模块或其他复杂仪器，这限制了其在POCT中的应用。

目前大多数基于CRISPR的诊断方法使用Cas12和Cas13蛋白[6]；然而，在基于Cas12a的单管反应中，目标DNA与RPA的竞争性结合会导致DNA模板意外降解，从而影响检测效率[23]。此外，其对特定原间隔序列（PAM）的依赖性限制了crRNA设计的灵活性和靶向范围[24]、[25]。与其他CRISPR系统不同，Cas13针对单链RNA，消除对PAM或原间隔序列（PFS）的依赖性，从而提高了crRNA设计的灵活性[17]。在Cas13变体中，Cas13d体积更小，比其他Cas13蛋白更容易纯化，但其应用尚未得到充分探索[26]、[27]。在我们之前的研究中[28]、[29]，EsCas13d在病毒检测中表现出优异性能；但我们的研究遇到了一些关键限制：（1）依赖实验室核酸提取；（2）非冻干试剂影响运输和储存；（3）缺乏无仪器条件下的验证；（4）对一步法所需缓冲液成分的研究不足。

PCV2是一种全球流行的病原体，会导致猪圆环病毒相关疾病（PCVAD），引发免疫抑制并使猪易受共感染，每年造成数十亿美元的经济损失[30]。我们利用PCV2作为模型来验证SHIELD平台在病毒检测中的有效性。SHIELD将RPA、T7转录和Cas13d检测整合到一步检测中，从而最小化了工作流程的复杂性并缩短了反应时间。本研究中使用的快速核酸释放试剂克服了传统提取方法的复杂性和对仪器的依赖性，提供了比基于加热的HUDSON方法[31]更简便的替代方案，并满足了POCT对无仪器环境的要求。此外，SHIELD在室温下进行反应，并使用快速核酸释放试剂，实现了现场检测，提高了时间和空间的灵活性。此外，改良的冻干试剂的研制便于运输和储存。这些进展使SHIELD成为资源有限环境中快速、灵敏且易于应用的诊断工具。

实验步骤片段

病毒裂解

PCV2、PRV、PRRSV、JEV、PEDV、CSFV和GETV的样本由四川省四川农业大学提供。使用商用核酸提取试剂提取病毒DNA或RNA，随后通过逆转录合成cDNA，并与DNA一起储存在-80°C下。

为了评估两步法和一步法SHIELD方法的临床适用性，样本按照世界卫生组织推荐的生物安全协议无菌采集。

SHIELD原理

我们开发了一种快速、可现场部署且无需仪器的CRISPR/EsCas13d诊断系统，称为SHIELD。如图1所示，拭子样本使用无需提取的试剂处理，随后进行一步SHIELD反应，该反应将RPA、T7转录和CRISPR/Cas13d检测整合到一个步骤中。双链DNA扩增子在正向引物的5′端带有T7启动子，从而促进其转录为单链RNA。

讨论

近年来，人类和动物的传染病爆发给全球健康带来了巨大压力[36]、[37]。持续的现场流行病学监测至关重要，因为早期检测和及时干预对于遏制传播和减轻生产影响至关重要[38]。在这种情况下，快速、灵敏和准确的基于核酸的POCT技术的发展变得越来越重要。其中，CRISPR-Dx技术

结论

总之，本研究成功建立了一种基于RPA-CRISPR/EsCas13d的快速、灵敏且可视化的单步检测方法，显示出对PCV2的优异灵敏度和特异性。快速核酸释放试剂的应用以及在室温和体温下进行反应的能力使SHIELD几乎不需要专用仪器。此外，冻干工艺简化了操作流程。

CRediT作者贡献声明

Jia-qi Duan：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，软件，资源，方法学，调查，数据分析，数据管理。Yang-ming Dai：软件，资源，方法学。Tong Xu：可视化，验证，方法学。Yuan-meng Wang：可视化，软件，方法学。Lei Zhao：方法学，数据分析。Dong You：可视化，软件，方法学。Fang Wu：方法学，数据分析。Si-Yuan Lai：监督，概念构思。

出版同意

所有内容均不适用。

伦理批准和参与同意

涉及动物实验的研究获得了四川农业大学实验动物管理委员会的批准（批准编号20240528）。这些研究遵循了当地法规和机构协议。已从动物所有者处获得书面同意，允许它们参与本研究。本手稿不包含任何与人类相关的研究内容，也不包含可能识别个人身份的数据或图像。

资金声明

作者声明本研究及/或文章的发表获得了财政支持。该工作得到了国家重点研发计划（项目编号2024YFD1800500，“重大猪病综合预防、控制和净化技术的研究与应用”；项目编号2024YFD1800102，“重要野生动物疾病预防和控制关键技术的研究”）和四川省重大项目的支持

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。