体外和计算机模拟方法评估植物化合物作为Rhipicephalus microplus和R. decoloratus中谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的作用

《Molecular and Biochemical Parasitology》：In vitro and in silico evaluation of plant compounds as inhibitors of glutathione S-transferase from Rhipicephalus microplus and R. decoloratus

本研究通过体外实验和分子对接技术，评估了7种植物化合物对蜱虫Rhipicephalus microplus和R. decoloratus重组GST的抑制作用，发现3β- Stearioxy-olean-12-ene、naringenin、quercitrin和rutin具有显著抑制活性，为开发新型植物源性灭蜱剂提供了依据。

　　

瓦利森·安德烈·多斯桑托斯·贝泽拉（Wallyson André dos Santos Bezerra）|克劳迪娅·昆蒂诺·达罗查（Claudia Quintino da Rocha）|伊塔巴贾拉·达席尔瓦·瓦兹·朱尼奥尔（Itabajara da Silva Vaz Junior）|沙菲·乌拉（Shafi Ullah）|瓦尔特·菲尔盖拉·德阿泽维多·朱尼奥尔（Walter Filgueira de Azevedo Junior）|亚历山德拉·马丁斯·多斯桑托斯·索亚雷斯（Alexandra Martins dos Santos Soares）

亚马逊生物多样性与生物技术研究生项目 - Bionorte，马兰豪联邦大学（Universidade Federal do Maranh?o），巴西圣路易斯（S?o Luís，MA）

摘要

蜱虫是一种广泛分布的外寄生虫，能够传播多种病原体，并对畜牧业生产造成重大损失。蜱虫对商业杀螨剂的抗性日益普遍，这促使人们寻找具有潜在杀蜱效果的新分子。在可能的靶点中，谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）在解毒过程中起着核心作用，因此成为克服杀螨剂抗性的理想候选者。本研究通过体外（in vitro）和计算机模拟（in silico）方法，检测了植物化合物对来自Rhipicephalus microplus（rGST-Rm）和R. decoloratus（rGST-Rd）的重组GSTs的抑制活性。测试的化合物包括3β-硬脂氧-奥莱安-12-烯（3β-stearioxy-olean-12-ene）、豆甾苷（diosgenin）、槲皮素（quercitrin）、橙皮苷（naringenin）、鞣花酸（ellagic acid）、芸香苷（rutin）和槲皮素（quercetin），这些化合物属于不同的化学类别，包括三萜类、甾体、多酚和黄酮类。体外实验表明，3β-硬脂氧-奥莱安-12-烯和橙皮苷的IC??值分别为148.2 μM和160.7 μM；对于rGST-Rd，槲皮素（IC?? = 37.7 μM）、橙皮苷（IC?? = 177.7 μM）和芸香苷（IC?? = 115.0 μM）也表现出抑制作用。分子对接分析预测了这些化合物与蜱虫GSTs之间的相互作用。总体而言，研究结果支持将GST抑制作为杀螨剂开发策略的潜力，并表明某些植物化合物可能成为未来蜱虫控制方法的起点。

引言

蜱虫是具有高度兽医重要性的吸血外寄生虫，威胁多种宿主物种，其中牛受影响最为严重。它们的吸血行为会导致皮肤损伤和体重下降，以及牛奶、肉类和整体产品质量的下降[1]。Rhipicephalus属的蜱虫——尤其是R. microplus和R. decoloratus——是危害牛最严重的寄生虫之一[2],[3]。这些物种的地理分布部分重叠，并能传播多种病原体，对畜牧业系统和全球经济构成严重挑战[4],[5]。此外，蜱虫对合成杀螨剂的广泛抗性逐渐削弱了这些杀螨剂的效力[6],[7]。

目前开发新的控制策略的努力越来越多地涉及天然和合成化合物[8]。这种方法侧重于阐明蜱虫的关键生理过程，以实现针对寄生虫特异性酶的选择性抑制[9],[10]。其中，谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）（EC 2.5.1.18）因其在解毒外源物质和其他有害化合物中的作用而受到特别关注[1],[11],[12],[13],[14]。抑制GSTs会削弱蜱虫的防御能力，增加其对外源性和内源性化合物的敏感性，从而提供一种潜在的创新和可持续的寄生虫控制方法[15],[16],[17]。

植物能够合成具有抗菌和抗寄生虫特性的多种化合物，这些分子正被研究作为蜱虫控制的候选替代品[18],[19],[20],[21]。其中，黄酮类、多酚和三萜类已被证明对多种蜱虫具有杀螨效果[22],[23],[24]。值得注意的是，一些化合物被报道为GST抑制剂，使其成为控制R. microplus的潜在候选物[17],[23]。

计算方法加速了具有潜在杀螨效果的分子的发现[25]。特别是分子对接技术——用于估计候选配体在催化位点或别构位点上的结合亲和力——有助于在实验评估前优先筛选抑制剂[26],[27]。将计算机模拟预测与体外实验相结合，扩展了天然酶抑制剂（包括GST抑制剂）的发现，用于蜱虫控制[28],[29],[30]。例如，我们之前利用分子对接结合体外实验证明了从Fridericia platyphylla中分离出的二聚体黄酮（brachydins）能够抑制Rhipicephalus microplus的GST，IC??值为97–110 μM[17]。同样，植物化合物反式茴香脑（trans-anethole）抑制了饱食的R. microplus雌性的GST活性[31]，而植物衍生的化合物pistagremic acid在计算机模拟中显示出对R. microplus GST的亲和力，并在200 ppm浓度下导致86%的幼虫死亡[28]。

鉴于开发新型蜱虫控制化合物的科学与经济意义，以及植物化合物所表现出的多种生物活性，本研究结合了计算机模拟和体外方法，研究了植物化合物库中对R. microplus和R. decoloratus GSTs的抑制效果。

部分内容片段

选定的天然化合物

本研究从马兰豪联邦大学（UFMA）化学与天然产物实验室（LQPN-UFMA）的植物化合物库中选取了七种化合物。豆甾苷、槲皮素和橙皮苷从巴西圣保罗的Sigma-Aldrich有限公司购买。化合物3β-硬脂氧-奥莱安-12-烯、鞣花酸、芸香苷和槲皮素之前已经过纯化[32],[33],[34]。

Rhipicephalus microplus和R. decoloratus重组GSTs的制备及抑制实验

R. microplus（rGST-Rm）和R. decoloratus（rGST-Rd）的重组GSTs已在中表达

rGST-Rd和rGST-Rm的重组生产与纯化

R. decoloratus和R. microplus的重组GSTs在E. coli中表达。纯化的R. microplus和R. decoloratus GSTs的SDS–PAGE分析显示其分子量约为25 kDa，与氨基酸序列预测的质量一致。这一结果通过使用抗蜱虫GST兔抗体的Western blot分析得到了进一步验证（图1）。SDS–PAGE和Western blot分析中均出现预期分子量的单一条带，证实了这一点

讨论

合成杀螨剂仍在兽医实践和一定程度上的人类医学中广泛用于寄生虫控制。然而，杀螨剂抗性的日益增加凸显了迫切需要替代控制策略[50]。人们越来越关注寻找新的生物活性分子，特别是对蜱虫酶靶点具有更强效果和选择性的植物化合物，这些化合物成为寄生虫控制的潜在候选者。

结论

本研究表明，选定的植物化合物能够在体外抑制Rhipicephalus microplus和R. decoloratus的重组谷胱甘肽S-转移酶，这一发现得到了分子对接分析的支持。具体而言，3β-硬脂氧-奥莱安-12-烯和橙皮苷抑制了rGST-Rm，而槲皮素、橙皮苷和芸香苷对rGST-Rd也表现出抑制作用。这些发现强调了GSTs作为分子靶点的重要性，并突显了结合

伦理声明

实验程序遵循了马兰豪联邦大学（UFMA）动物实验伦理委员会的指导方针，并获得了批准（协议编号23115.004153/2022–58）。

写作过程中的人工智能（AI）和AI辅助技术声明

在准备本稿时，作者使用了ChatGPT来提升初稿的连贯性。使用该工具/服务后，作者根据需要对文本进行了审查和编辑，并对出版物的内容负全责。

CRediT作者贡献声明

伊塔巴贾拉·达席尔瓦·瓦兹·朱尼奥尔（Itabajara da Silva Vaz Junior）：撰写 – 审稿与编辑、资源获取、实验研究。沙菲·乌拉（Shafi Ullah）：方法学设计、实验研究、数据分析。瓦利森·安德烈·多斯桑托斯·贝泽拉（Wallyson André dos Santos Bezerra）：撰写 – 初稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析。克劳迪娅·昆蒂诺·达罗查（Claudia Quintino da Rocha）：撰写 – 审稿与编辑、资源获取、实验研究。瓦尔特·菲尔盖拉·德阿泽维多·朱尼奥尔（Walter Filgueira de Azevedo Junior）：撰写 – 审稿与编辑、实验研究。亚历山德拉·马丁斯·多斯桑托斯·索亚雷斯（Alexandra Martins dos Santos Soares）：撰写 – 审稿与编辑

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究部分得到了马兰豪州研究基金会（FAPEMA）（项目INFRA 03170/18、UNIVERSAL 00869/22）和FAPEMA IECT生物技术/研究与项目资助机构（FINEP）（项目2677/17）的支持。此外，巴西高等教育人员培训协调委员会（CAPES，财务代码001也提供了资金支持。巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）（项目306298/2022–8也对该研究提供了支持。作者感谢