缺乏神经雄激素受体的雄性小鼠中，视前内侧区域的胶质细胞活化以及血脑屏障通透性增加

《Molecular and Cellular Endocrinology》：Glial activation and increased blood brain barrier permeability in the medial preoptic area of male mice lacking neural androgen receptor

雄性小鼠神经雄激素受体（Ar）敲除导致星形胶质细胞（GFAP、NDRG2）和微胶质（Iba-1）激活，伴随iNOS、COX-2等炎症分子在血脑屏障（BBB）附近表达，以及BBB通透性增加和紧密连接蛋白（Claudin-5、ZO-1）水平下降。与野生型相比，这些改变仅在神经Ar敲除模型中出现。

　　

Nida Karameh | Afnan Atallah | Danaé Nuzzaci | Valérie Grange-Messent | Sakina Mhaouty-Kodja

索邦大学，法国国家科学研究中心（CNRS），法国国家健康与医学研究院（INSERM），发展、适应与衰老研究组（Dev2A），法国巴黎75005

摘要

我们之前的研究表明，成年雄性小鼠体内的睾酮水平下降会引发神经雄激素受体（Ar）的表达下调，从而导致神经炎症以及血脑屏障（BBB）通透性的增加，这种变化主要发生在中脑前视区。在本研究中，我们探讨了神经Ar缺失对雄性小鼠胶质细胞功能及BBB完整性的影响。为此，我们使用了通过Cre-loxP技术敲除神经前体细胞中Ar基因的对照组和突变体小鼠。神经Ar的缺失引发了胶质细胞的活化，这体现在针对星形胶质细胞标志物（胶质纤维酸性蛋白-GFAP和N-myc下游调控基因2）和小胶质细胞标志物（离子化钙结合适配分子1）的免疫反应增强。在神经Ar敲除小鼠的中脑前视区毛细血管附近，检测到了Fluoro-Jade? C荧光标记物的增加，同时发现了炎症相关分子（如诱导型一氧化氮合酶iNOS和环氧化酶2 COX2）的存在。对BBB完整性的分析显示，与对照组相比，突变体小鼠的BBB对Evans Blue示踪剂的通透性以及内源性免疫球蛋白的通透性均有所提高。此外，电子断层扫描还观察到毛细血管内皮紧密连接结构的改变。这些效应仅限于神经Ar缺失的情况，因为表达野生型Ar等位基因并携带Cre转基因的雄性小鼠并未出现GFAP免疫反应、BBB通透性或Fluoro-Jade? C荧光标记的变化。

总体而言，这些数据表明神经Ar在睾酮调控雄性小鼠中脑前视区星形胶质细胞、小胶质细胞功能及BBB完整性方面起着关键作用。

引言

在任何生命阶段干扰雄性动物的雄激素作用都会扰乱其性行为表现。具体而言，雄性小鼠中神经雄激素受体（Ar）的缺失会减少超声波发声的频率，延长发起交配行为、插入动作及达到射精所需的时间（Dombret等人，2017年；Picot等人，2014年；Raskin等人，2009年、2012年）。神经Ar缺失的雄性小鼠对具有接受性行为的雌性仍表现出正常的嗅觉偏好，这说明行为缺陷主要发生在嗅球下游的化学感觉区域。其中，下丘脑中脑前视区是调控雄性性行为的整合中枢（Torres等人，2024年）。目前尚需进一步研究神经Ar缺失究竟会引起哪些细胞层面的变化。

我们之前的研究已证实，成年雄性小鼠体内睾酮水平下降会激活星形胶质细胞和小胶质细胞，这表现为中脑前视区胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和离子化钙结合适配分子1（Iba-1）的免疫反应增强（Atallah等人，2017年）。同时，炎症相关分子（如诱导型一氧化氮合酶iNOS、环氧化酶2 COX-2、白细胞介素1β IL-1β和肿瘤坏死因子TNF）的表达也有所增加。这些变化伴随着血脑屏障（BBB）对Evans Blue示踪剂和内源性循环免疫球蛋白IgG通透性的提高。电子断层扫描还显示，紧密连接结构出现紊乱，尤其是紧密连接蛋白claudin-5和Zonula Occludens-1（ZO-1）的水平降低。有趣的是，给去势的雄性小鼠补充睾酮后，BBB通透性和紧密连接完整性得以恢复，神经炎症也得到了抑制（Atallah等人，2017年）。

目前尚不清楚这些细胞变化是否与神经Ar直接相关。关于Ar基因在这些过程中的作用机制，现有数据主要来自创伤性脑损伤、脑部其他区域的病变或神经退行性病变的研究（Asbelaoui等人，2024年；Bielecki等人，2016年；Chen等人，2021年）。此外，在雄性大脑尤其是中脑前视区，睾酮不仅可以通过AR发挥作用，还可以在局部转化为神经雌二醇，进而刺激雌激素受体（ER）。此外，Ar基因不仅表达在神经细胞中，还存在于小胶质细胞和脑血管内皮细胞中（Ahmadpour等人，2022年；García-Ovejero等人，2002年）。

本研究旨在阐明神经Ar在睾酮调控雄性小鼠中脑前视区星形胶质细胞、小胶质细胞反应及BBB完整性中的作用。为此，我们使用了从胚胎第10天起就缺乏神经Ar基因的小鼠模型（Raskin等人，2009年、2012年），此时睾丸尚未开始分化，因此睾酮的围产期效应尚未发挥作用。在该条件性敲除小鼠模型中，利用Nestin启动子和神经系统特异性增强子（Nes-Cre）驱动的Cre重组酶，选择性地敲除了神经前体细胞（包括神经元和胶质细胞）中的Ar基因（Raskin等人，2009年）。通过免疫组化方法分析了对照组和突变体小鼠的脑组织，检测星形胶质细胞（GFAP和N-myc下游调控基因2 NDRG2）、小胶质细胞（Iba-1）及神经炎症（iNOS和COX-2）的特异性标志物。同时，还利用Evans Blue示踪剂和内源性IgG免疫标记技术评估了BBB通透性，并通过电子断层扫描观察了紧密连接结构。

实验方法

实验动物

实验所用小鼠为C57BL/6 J品系，其中一部分携带floxed Ar基因并携带NesCre转基因（突变体，AR^NesCre），另一部分不携带该转基因（对照组，AR^fl/Y）。此外，还获得了表达野生型Ar等位基因并携带或不携带NesCre转基因的雄性小鼠（AR^wt/Y，NesCre）。对照组和突变体小鼠在断奶后被共同饲养于光照12小时、黑暗12小时的标准化环境中，饲养温度为22°C。

神经Ar缺失对雄性小鼠中脑前视区星形胶质细胞和小胶质细胞标志物的影响

对照组（AR^fl/Y）和突变体（AR^NesCre）小鼠的脑组织被用于检测星形胶质细胞标志物GFAP和NDRG2的免疫反应。NDRG2基因家族的成员在星形胶质细胞活化早期其表达会增加（Flügge等人，2014年；Takarada-Iemata等人，2014年）。图1A、B和1D-E中的数据表明，突变体小鼠中GFAP和NDRG2免疫反应阳性的细胞数量显著增加（分别增加了93%和25%）。

讨论

本研究结果表明，神经Ar的缺失会激活雄性小鼠中脑前视区的星形胶质细胞和小胶质细胞，且在微血管附近检测到促炎分子（如COX2和iNOS）的免疫反应。BBB通透性也受到影响，同时毛细血管内皮紧密连接结构的超微结构发生了改变。这些数据共同揭示了神经Ar在睾酮调控过程中的生理作用。

结论

本研究首次证实，神经Ar参与了雄性小鼠中脑前视区胶质细胞功能及BBB完整性的调节。此外，这一神经信号通路至少部分解释了之前观察到的睾酮水平下降所导致的这些生理变化（Atallah等人，2017年）。因此，无论是睾酮水平还是神经Ar表达的异常，都可能引发胶质细胞的活化及BBB功能的紊乱。

CRediT作者贡献声明

Nida Karameh：实验设计。Afnan Atallah：实验实施。Danaé Nuzzaci：实验设计、数据分析和修订、监督、概念构建。Valérie Grange-Messent：论文撰写、审稿与编辑、监督、数据分析、概念框架的完善。Sakina Mhaouty-Kodja：论文撰写、审稿与编辑、初稿撰写、监督、资金申请、概念框架的完善。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本研究结果的财务利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了法国国家研究机构（Agence Nationale de la Recherche，2018年）、索邦大学（Sorbonne Université）、法国国家科学研究中心（CNRS）和法国国家健康与医学研究院（INSERM）的支持。同时，我们也感谢法国巴黎-塞纳生物研究所（Institut de Biologie Paris-Seine，巴黎）提供的实验动物和成像技术支持。