《Molecular & Cellular Proteomics》：Recent advances in proximity labeling-based subcellular proteomic mapping
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这篇综述系统梳理了酶介导邻近标记（PL）技术的最新进展，重点介绍了TurboID和APEX2等工具在绘制亚细胞蛋白质组图谱方面的突破。文章详细探讨了功能PL（如解码PTMs、追踪蛋白转运、量化蛋白周转）和空间分辨互作组图谱（涵盖蛋白-蛋白、RNA/DNA-蛋白及小分子-蛋白互作），并评述了光激活PL（optoPL）和免疫PL（immunoPL）等新技术在提升时空分辨率和免遗传操作应用中的优势，为细胞生物学研究提供了强大的方法学支持。
功能邻近标记：超越简单定位的多维信息获取
邻近标记（PL）技术的核心优势在于其能够活细胞内原位捕获蛋白质的时空动态信息。传统PL技术如TurboID和APEX2已被广泛应用于蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）研究，而“功能PL”概念的提出将其应用拓展至蛋白质功能亚类的精细图谱绘制。通过将PL与功能蛋白富集策略（如亲和纯化或活性标记）相结合，研究人员能够在特定亚细胞区室内靶向映射具有特定功能的蛋白质群体。
解码亚细胞翻译后修饰
翻译后修饰（PTMs）如磷酸化和糖基化对蛋白质功能具有精细调控作用。Liu等人开发的SubMAPP技术将TurboID与磷酸肽富集技术相结合，实现了活细胞和活体生物亚细胞蛋白质组磷酸化动态的实时监测。类似地，APEX标记与磷酸化或O-GlcNAc糖基化蛋白富集联用，也成功揭示了内质网（ER）腔内新的激酶底物及其在ER应激期间的变化。此外，通过将PL酶或光催化剂特异性地引入到PTM上，可以标记周围相互作用的蛋白质。例如，μMAP技术利用铱基光催化剂，通过Dexter能量转移产生反应性卡宾中间体，应用于唾液酸化蛋白质组局部微环境的分析。
绘制蛋白质转运图谱
蛋白质的精确定位对其功能至关重要，错误定位与癌症和神经退行性疾病等多种疾病密切相关。TransitID技术的出现突破了传统方法的局限，它通过在不同细胞器上标记正交的PL酶（如TurboID和APEX2）来获取蛋白质转运的时空信息。在该工作流程中，TurboID在源细胞器被激活进行标记，经过一段可变的追踪期后，APEX2在目的地细胞器进行二次标记，从而明确鉴定出在特定时间内完成从源到目的地转运的蛋白质。该技术已成功应用于映射细胞器之间（如应激颗粒与核仁）以及不同细胞类型之间（如共培养的癌细胞和巨噬细胞）的蛋白质运输事件。
量化蛋白质周转速率
蛋白质周转动力学是调控生物活性的关键。prox-SILAC技术将PL工具整合到脉冲稳定同位素标记（pulse-SILAC）工作流程中，实现了亚细胞分辨率下的蛋白质周转速率测量。在该方法中，细胞在含有重同位素标记的赖氨酸和精氨酸的培养基中培养数小时，随后使用过氧化物酶对酶附近的所有蛋白质（包括新旧蛋白质）进行生物素化标记。标记的蛋白质经富集后进行LC-MS/MS分析，从而获得特定亚细胞区域的蛋白质合成与降解动态信息。相较于传统的细胞器分离方法，prox-SILAC操作更简便，应用潜力更广。
空间分辨互作组图谱
绘制蛋白质-蛋白质相互作用
APEX标记与交联质谱（CXMS）的结合（APEX-CXMS）是近期的一项重要进展。该技术利用APEX的快速生物素化能力和CXMS高效的蛋白质相互作用分析能力，实现了活细胞中具有高空间分辨率的亚细胞互作组分析。该技术已成功鉴定了线粒体和细胞核中数百对蛋白质相互作用，其中许多是先前未被表征的。
RNA中心蛋白质互作组
RNA与蛋白质的相互作用在转录、翻译和细胞应激响应中扮演核心角色。为了解析具有亚细胞精度的RNA结合蛋白（RBPs），APEX-PS技术将过氧化物酶催化的PL与交联蛋白-RNA复合物的有机-水相分离相结合，生成了位于细胞核、核仁和线粒体外膜（OMM）的RBPs综合数据集。此外，RaPID、RNA-BioID、CARPID和CBRPP等RNA中心方法，利用MS2、BoxB或CRISPR-dCas13系统将生物素连接酶或APEX2靶向特定的RNA分子，从而研究与该RNA片段相互作用的蛋白质。
DNA中心蛋白质互作组
基因表达调控主要依赖于与基因调控元件相互作用的蛋白质伴侣。CasID及其改进版本利用dCas9将PL酶（如BirA*或APEX2）定位到特定的DNA序列，标记并鉴定邻近的蛋白质。PROBER策略则通过构建包含目标DNA序列的高拷贝附加体，与BASU和GAL4融合表达相结合，实现对与特定DNA区域结合的相互作用蛋白的生物素化标记。
小分子-蛋白质互作组
PL技术在小分子-蛋白质相互作用鉴定领域也开始崭露头角。PROCID和Drug-ID等方法分别将TurboID或BASU生物素连接酶与HaloTag或SNAP-tag融合，利用经过HaloTag配体或SNAP-tag底物修饰的小分子，实现对药物相互作用蛋白质组的标记和鉴定。这些方法在发现未表征的药物相互作用方面显示出巨大潜力。
光激活邻近标记
光激活PL（optoPL）方法利用光来激活被“笼蔽”的PL酶或光敏分子，从而提供更高的时间精度。光门控TurboID，如photoTurbo和LOV-Turbo，通过在黑暗中将酶活性降至最低，并在光照下恢复活性，实现了对生物素化过程的精确时空调控。此外，基于蛋白质光催化剂（如miniSOG）和合成小分子光催化剂（如μMap中使用的铱配合物）的optoPL方法，通过产生单线态氧、卡宾或氮宾等高活性中间体，实现了对邻近生物分子的标记，其空间分辨率可通过调节反应中间体的寿命和扩散系数进行调控。
免疫邻近标记
免疫PL（immunoPL）方法无需遗传操作即可在原生组织和临床样本中进行PL。例如，BAR技术使用靶向Lamin A/C的一抗和HRP标记的二抗，将HRP定位到核纤层，从而标记并鉴定其邻近蛋白质组。类似地，BLITZ技术利用GFP结合纳米抗体（GBP）与TurboID的融合，靶向GFP融合蛋白，可用于在活体斑马鱼等模式生物中绘制组织特异性相互作用组。针对RNA的免疫PL方法，如HyPro和O-MAP，通过原位杂交将APEX2或HRP引导至目标RNA，系统性地鉴定其邻近的蛋白质组和转录组。
总结与展望
邻近标记技术已从简单的蛋白质丰度测量，发展到能够提供亚细胞PTMs、蛋白质转运、周转和生物分子相互作用等多维信息的强大工具。optoPL和immunoPL等技术进一步补充了现有的酶介导PL方法。未来，开发更具正交性的PL酶、提高体内应用的兼容性、结合超分辨率成像等技术，将是该领域的重要发展方向，有望在细胞生物学、疾病机制和药物研发等领域带来更深层次的见解。
