《Neurobiology of Aging》：Quantifying calretinin-labeled afferent terminals in vestibular sensory epithelia of young and older gerbils
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本研究通过荧光免疫组化和共聚焦显微术，比较老年（≥3年）与成年仓鼠前庭器官中 calretinin 阳性 calyx-only afferent 终末器数量，发现老年组 utricle 中数量显著减少，而 crista 无显著变化，提示 calyx-only afferent 终末器部分丢失与老化相关的前庭功能障碍有关。
安娜·唐齐洛（Anna Dondzillo）|泰勒·鲍尔（Tyler Bauer）|凯瑟琳·金（Kathryn King）|安东尼·彭（Anthony Peng）|凯瑟琳·J·伦尼（Katherine J. Rennie）
科罗拉多大学医学院耳鼻喉科-头颈外科，奥罗拉，科罗拉多州
摘要
随着年龄的增长，前庭功能障碍变得越来越普遍，据估计，80岁以上的人中有超过80%存在与前庭功能障碍相关的平衡问题。在前庭感觉器官中，感觉毛细胞将毛束的运动转化为受体电位，这些信息随后通过前庭传入神经的电活动传递到大脑。前庭传入神经分为三种类型：仅支配杯状结构的传入神经（calyx-only afferents）负责一个或多个I型毛细胞的神经支配；仅支配小突起的传入神经（bouton afferents）负责II型毛细胞的神经支配；而双重类型的传入神经（dimorphic afferents）则同时接触两种类型的毛细胞。仅支配杯状结构的传入神经仅存在于前庭神经上皮的中心区域，并具有独特的生理特征。先前的研究表明，随着年龄的增长，前庭介导的反应会发生变化，同时啮齿动物内耳上皮中的传入突触也会发生退化。然而，仅支配杯状结构的传入神经的突触是否也会随着年龄的增长而丧失，目前尚未明确。在本研究中，我们使用了一种针对钙离子结合蛋白calretinin的抗体作为标记物，来检测不同年龄沙鼠前庭上皮中仅支配杯状结构的传入神经末梢。通过荧光免疫组织化学和共聚焦成像技术，我们识别了年轻（1-2个月）、成年（1-2年）和老年（≥3年）沙鼠的椭圆囊和耳石器中的传入神经元。统计了前庭上皮中心区域中单个、双个和三个calretinin阳性末梢的数量。总体而言，从成年到老年动物，这些末梢的数量略有减少，这表明前庭功能的下降可能与仅支配杯状结构的calretinin阳性传入神经的局部丧失有关。
引言
我们对运动和方向感的感知依赖于前庭毛细胞及其传入神经的感官输入，这些神经驱动着维持姿势、头部位置和整体平衡功能的反射（Eatock和Songer，2011年）。与年龄相关的平衡能力下降导致老年人跌倒次数增加，从而增加了受伤甚至死亡的风险。前庭功能也会随之下降；40岁及以上的美国成年人中有35%在姿势测试中表现出功能障碍，而在80岁及以上的老年人中这一比例上升至85%（Agrawal等人，2009年）。啮齿动物的前庭感觉处理能力也会随着年龄的增长而下降（Paplou等人，2023年；Wan等人，2019年）。在羊膜动物中，半规管的囊状器官（椭圆囊和球囊）和壶腹器官（耳石器）都含有I型和II型毛细胞。这些感觉细胞将毛束的机械运动转化为电信号，然后由传入神经元传递到大脑。在哺乳动物中，这两种类型的毛细胞分布在前庭器官的神经上皮中。每个末端器官内部都存在区域差异，从而形成了耳石器的中央和外周区域，以及椭圆囊和球囊的条纹区和条纹外区域（Desai等人，2005a；Desai等人，2005b；Lee等人，2025年；Li等人，2008年；Lysakowski等人，2011年）。哺乳动物中初级传入神经元对毛细胞的支配非常复杂，根据生理和形态特征，传入神经元主要分为三类（Baird等人，1988年；Fernandez等人，1990年）。形成小突起型突触的传入神经元接收来自神经上皮外周区域的II型毛细胞的输入，其特征是高度规律的放电模式。同时支配I型和II型毛细胞的传入神经元被称为双重类型传入神经元，具有中等放电特性。仅支配杯状结构的传入神经元具有杯状突触末梢，围绕一个或多个I型毛细胞的基底外侧膜。这些神经元仅存在于耳石器的中央区域和椭圆囊及球囊的条纹区域，其特征是相位性反应和高度不规则的放电模式。这些中央区域的传入神经元对刺激的反应频率（反应增益）随频率的增加而增加的速度比更外周位置的传入神经元更快。这种反应动态的变化使得条纹区和中央区域的传入神经元对快速启动或急转弯等运动变化更为敏感（Eatock和Songer，2011年；Goldberg，2000年）。
大多数仅支配杯状结构的传入神经元属于双重类型纤维，它们既存在于神经上皮的中央区域也存在于外周区域。位于中央的仅支配杯状结构的传入神经元表达钙结合蛋白calretinin，这可以作为一种标记物来识别这些纯粹的杯状结构传入神经元（Leonard和Kevetter，2002年）。Calretinin的表达还用于定义椭圆囊和条纹区内的一个称为条纹区的细胞带（Desai等人，2005b；Li等人，2008年）。Calretinin是一种存在于某些脑神经元和某些感觉器官神经元中的细胞质钙结合蛋白（Hackney等人，2005年；Lee等人，2025年；Liu和Davis，2014年；Schwaller，2020年；Rogers，1987年）。由于其快速的钙离子结合特性，人们认为它能够调节神经元活动并保护细胞免受有毒的细胞质钙离子浓度的影响（Lenzi和Roberts，1994年）。谷氨酸是毛细胞释放的主要兴奋性神经递质，它与杯状结构末梢中的AMPA受体结合以产生突触后反应（Kirk等人，2017年；Sadeghi等人，2014年）。在杯状结构突触中，量子传递通过专门的带状突触发生，此外还描述了一种非囊泡形式的非量子传递（Eatock，2018年）。这两种突触传递方式可能都受到离子浓度和毛细胞与杯状结构内表面间隙中谷氨酸溢出量的影响（Sadeghi等人，2014年）。过多的间隙谷氨酸可能会促进钙离子内流，并对听觉和前庭毛细胞的传入突触造成兴奋性损伤（Brugeaud等人，2007年；Sebe等人，2017年）。
多项研究表明，仅支配杯状结构的传入神经元特别容易受到损伤。在啮齿动物中，使用耳毒性药物后，I型毛细胞与其杯状结构之间的突触连接会受损，导致杯状结构收缩和I型毛细胞的部分丧失（Greguske等人，2019年；Maroto等人，2023年；Sedo-Cabezon等人，2015年）。在豚鼠的耳石器中，鼓室内注射庆大霉素会导致I型毛细胞和杯状结构末梢的广泛丧失（Hirvonen等人，2005年），并且在应用庆大霉素后两周内，表达calretinin的仅支配杯状结构的传入神经末梢会从毛细胞上回缩（Sultemeier和Hoffman，2017年）。大鼠暴露于噪音环境中会导致球囊条纹区中calretinin标记的杯状结构传入神经元数量显著减少（Stewart等人，2020a）。关于前庭传入神经元是否随着年龄的增长在耳石器和半规管器官中丧失，目前尚不清楚。虽然已有研究报道了啮齿动物前庭诱发电位（VsEPs）随年龄增长的传入活动减少，但导致这些变化的潜在机制仍不清楚（Mock等人，2011年；Wan等人，2019年）。在衰老的小鼠的椭圆囊中，观察到与条纹外I型毛细胞杯状结构相关的双重类型杯状结构末梢的突触丧失，而仅支配杯状结构的传入神经元在条纹区似乎保持完整（Wan等人，2019年）。关于衰老小鼠中仅支配杯状结构传入神经元末梢的条纹区变化的研究尚未进行。一项使用嵌入的沙鼠耳石器薄切片的研究报告指出，与年轻动物相比，老年动物的calretinin和calbindin染色的杯状结构有显著减少（Kevetter和Leonard，2002年）。随后的一项使用逆向标记的研究表明，老年沙鼠的耳石器中央区域的杯状结构末梢发生了丧失（Leonard和Kevetter，2007年）。总的来说，这些先前的研究是在不同物种中进行的，仅检查了神经上皮中选定的耳石器或耳石器器官区域。在这里，我们检查了衰老沙鼠的整个耳石器和椭圆囊，以研究calretinin阳性杯状结构末梢的数量是否随年龄变化，以及不同器官之间的易感性是否存在差异。为了研究不同器官中的传入神经元末梢，我们使用了荧光免疫组织化学和共聚焦显微镜。我们在沙鼠生命周期的三个不同年龄段检查了整个耳石器和椭圆囊中的calretinin阳性杯状结构传入神经元群体。统计了前庭上皮中心区域中单个、双个和三个calretinin阳性杯状结构末梢的数量。我们发现，从成年到老年动物，calretinin染色的杯状结构末梢的数量有所减少，这一减少在椭圆囊中具有统计学意义，但在耳石器中不明显。然而，在老年动物中，包裹多个I型毛细胞的复杂杯状结构仍然存在。
研究片段
动物
蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus）来自一个现场的繁殖群体。它们的使用得到了科罗拉多大学机构动物护理和使用委员会的批准，符合NIH的指导方针。我们共使用了20只动物（10只雌性），将其分为三个年龄组：1-2个月（1-2mo）、22-25个月和36-42个月。表1显示了每个年龄组使用的动物数量及使用的前庭器官。这些动物在两个实验室之间共享。
结果
我们使用定量荧光免疫组织化学技术检测了衰老对沙鼠前庭器官中央（耳石器）和条纹区（椭圆囊）区域中仅支配杯状结构的传入神经元末梢支配模式的影响。抗calretinin抗体用于标记仅支配杯状结构的传入神经元，抗-tubulin-β3抗体用于标记所有传入神经元（包括仅支配杯状结构、双重类型和仅支配小突起的传入神经元）。抗calretinin抗体选择性地标记了中央区域的仅支配杯状结构的传入神经元。
讨论
我们利用荧光免疫组织化学和共聚焦显微镜研究了整个沙鼠生命周期中前庭感觉上皮的传入神经元支配模式。抗-tubulin-β3抗体标记了整个感觉上皮中支配毛细胞的神经元，而calretinin免疫反应仅限于前庭器官中央区域的一组传入神经元。如前所述，calretinin可以识别中央耳石器区域的仅支配杯状结构的传入神经元。
CRediT作者贡献声明
安娜·唐齐洛（Anna Dondzillo）：撰写 – 审稿与编辑、撰写原始稿件、数据可视化、验证、项目监督、方法论设计、实验实施、数据分析、数据管理。泰勒·鲍尔（Tyler Bauer）：实验实施。安东尼·彭（Anthony Peng）：撰写 – 审稿与编辑、资源获取、方法论设计、资金筹集。凯瑟琳·J·伦尼（Katherine J. Rennie）：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、资源获取、资金筹集、数据管理、概念构思。凯瑟琳·金（Kathryn King）：实验实施。
致谢
本项工作得到了NIH/NIA R01 AG073997（Rennie和Peng）、NIH/NIDCD R01DC0018786（Rennie）以及CU Anschutz研究孵化器计划（CU ASPIRE）的支持。
我们感谢科罗拉多大学Anschutz医学院先进光学显微镜核心设施的人员提供的成像协助。成像工作在科罗拉多大学Anschutz医学院神经技术中心的先进光学显微镜设施中进行，该设施部分得到了Rocky的支持。
