《Neurobiology of Disease》：GDF-11, GDF-15, Jag-1, and leptin in neuronal-derived extracellular vesicles as aging-related biomarkers to identify individuals at risk of Alzheimer's dementia: A pilot study
随着全球人口预期寿命的不断增长，阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）作为最常见的神经退行性痴呆，其患病率预计将显著上升，构成了日益严峻的公共卫生挑战。衰老是AD最强的风险因素。AD的疾病进程涵盖从临床前阶段，经轻度认知障碍（Mild Cognitive Impairment, MCI），到明显痴呆的连续过程。从神经病理学角度看，AD以β淀粉样蛋白（Aβ）斑块沉积、tau蛋白过度磷酸化为特征，同时伴有神经炎症、胰岛素抵抗和氧化应激等变化。衰老的大脑经历着一系列生物学改变，包括胰岛素抵抗、氧化应激升高、线粒体功能障碍、蛋白质稳态受损以及慢性低度炎症（即“炎性衰老”）。这些改变损害了神经元的完整性和通讯，从而创造了易感环境，使大脑易于发生神经退行性病变。然而，如何在出现明显临床症状之前，早期、准确地识别出有AD风险的个体，是目前面临的关键挑战。传统的生物标志物检测多依赖于脑脊液或神经影像学，这些方法或有创、或昂贵，限制了其大规模应用。因此，开发一种非侵入性、能够灵敏反映大脑内部病理变化的血液生物标志物，具有重大的科学和临床意义。
近年来，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs），特别是神经元源性细胞外囊泡（Neuron-Derived Extracellular Vesicles, nEVs）作为中枢神经系统中细胞间通讯的重要介质受到关注。nEVs携带蛋白质、脂质和核酸，能够反映其来源神经元的生理状态，并且与Aβ、tau和炎症介质等病理分子在大脑内的传播有关。由于nEVs能够穿过血脑屏障并在外周体液（如血浆）中被检测到，它们为监测AD相关分子变化提供了一种有前景的非侵入性方法，即“液体活检”。与直接测量血浆中的生物标志物相比，nEVs中的生物标志物与认知衰退、脑萎缩和临床结局的关联更强，并且在预测从MCI向AD转化方面显示出预测价值。尽管如此，nEVs在AD发病机制中的机制作用、其与年龄相关的动态变化以及性别特异性差异等领域仍存在研究空白。
为了深入探索这一问题，由Simona Lanzillotta、Virginia Boccardi等研究人员组成的团队在《Neurobiology of Disease》上发表了一项初步研究。该研究旨在评估一组与衰老和代谢相关的生物标志物在血浆和nEVs中的水平，并探讨它们与认知功能、大脑结构以及AD诊断的关系，同时利用死后脑组织样本进行验证，以评估nEVs生物标志物反映大脑病理变化的准确性。
研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术方法：研究纳入了28名受试者（14名AD患者和14名年龄匹配的认知健康对照），并使用了来自肯塔基大学Sanders-Brown衰老中心提供的独立队列的死后下顶叶（Inferior Parietal Lobule, IPL）脑组织样本（包括对照、临床前AD、MCI和AD病例）。他们通过多维度和认知评估（如MMSE、ADL、IADL量表）和磁共振成像（MRI）获取临床和脑结构数据。从血浆中分离总EV后，使用抗L1CAM抗体通过免疫捕获法特异性富集nEVs，并利用动态光散射（DLS）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）对nEVs进行表征（包括粒径和浓度），并通过蛋白质印迹法（Western Blot）验证其标志物（如CD81、Alix）和纯度（如排除APOA1、GM130污染）。最后，采用基于多重酶联免疫吸附试验（MILLIPLEX?）的多重生物标志物检测技术，同时定量测量nEVs、血浆和死后脑样本中一系列衰老相关生物标志物（包括GDF-11, GDF-15, Jag-1, Leptin, IL-6, IL-10, IL-18, FGF-21, CTACK, GnRH）的水平。数据分析则运用了包括相关性分析、逻辑回归模型、聚类分析在内的多种统计方法。
3.1. nEVs的表征
研究人员成功地从血浆中分离并富集了L1CAM阳性的nEVs。通过DLS和NTA分析确认了nEVs的粒径分布符合细胞外囊泡的特征，平均流体动力学直径在对照组和AD组之间无显著差异。蛋白质印迹分析显示，nEVs中跨膜标志物CD81和囊内标志物Alix显著富集，而脂蛋白APOA1和高尔基体标志物GM130则相对减少，证明了nEVs的成功分离和纯度。与总EVs相比，nEVs中L1CAM水平显著增加，证实了神经元来源囊泡的有效富集。
3.2. nEVs、血浆和死后脑样本中衰老标志物的水平
对nEVs和血浆中衰老相关生物标志物的测量发现，在AD组和对照组之间，单个生物标志物的水平在nEVs或血浆中均未显示出显著差异。值得注意的是，某些生物标志物（如GDF-11, GnRH, Jag-1）在血浆中的信号低于检测下限，但在nEVs中却能稳定检测到，表明nEVs富集提高了这些分子的可测性。线性回归分析显示，nEVs中的GDF-15和Leptin水平与血浆中的水平显著相关。对独立队列的死后IPL脑组织样本的分析同样未发现各诊断组（对照、临床前AD、MCI、AD）间生物标志物水平的显著差异，这与nEVs中的结果一致。
3.3. nEVs标志物的变化反映了死后脑样本中观察到的变化
为了检验nEVs生物标志物谱是否比血浆生物标志物更能反映大脑的分子改变，研究人员比较了生物标志物在nEVs、血浆和死后脑组织中的平均水平分布模式。结果显示，nEVs中的生物标志物分布模式与脑组织中的模式更为相似。Spearman相关性分析进一步证实，无论在对照组还是AD组，nEVs与脑组织之间的生物标志物丰度排名相关性均强于血浆与脑组织之间的相关性。这表明nEVs测量能更忠实地反映衰老大脑的分子谱。
3.4. 年龄与诊断的交互作用模型揭示了生物标志物谱中隐藏的差异
考虑到参与者年龄较大可能掩盖病理驱动效应，研究人员应用了线性混合模型来评估组间差异是否随年龄变化。分析发现，在nEVs中，GnRH、IL-6和Jag-1的水平存在显著的年龄与诊断交互作用；在血浆中，FGF-21、GDF-15、IL-10和IL-18也存在显著的交互作用。这表明年龄显著调节了诊断与生物标志物水平之间的关联，除非明确使用交互作用方法进行建模，否则年龄相关效应可能会掩盖疾病相关的差异。
3.5. 对照组受试者nEVs中的生物标志物在AD发病前预测功能下降
在认知健康的对照组受试者中，nEVs中的几个生物标志物（如GDF-11, IL-6, IL-18, Jag-1）与日常生活活动能力量表（ADL）和工具性日常生活活动能力量表（IADL）评分呈显著负相关，提示这些生物标志物的变化可能反映了在明显神经退行性变出现之前，为维持神经元稳态和功能自主性而激活的代偿机制。而在AD组中，这些关联性显著减弱。相比之下，血浆生物标志物与临床评分的显著关联很少。这表明nEVs能够提供与功能下降相关的早期分子变化信息。
3.6. 死后IPL组织中的相关性分析支持nEVs衍生的发现
对死后IPL脑组织的相关性分析揭示了生物标志物关联模式随AD疾病进展的动态变化。在认知健康个体和临床前AD中，GDF-11与GnRH之间存在强正相关，这与nEVs中观察到的这两个标志物之间的耦合关系相呼应。随着病理进展（MCI和AD），这些关联转向炎症介质（如IL-6, IL-10, Jag-1），表明细胞稳态被破坏和慢性神经炎症的出现。这些死后脑数据与nEVs中的发现一致，支持nEVs衍生的生物标志物能够捕捉大脑特异性分子变化。
3.7. nEVs生物标志物揭示了预测认知衰退的性别相关差异
性别分层分析揭示了AD进展中不同的生物标志物轨迹。在女性AD患者中，nEVs中的GDF-15水平显著高于男性AD患者和女性对照组，并且nEVs中GDF-15水平升高与女性更差的功能结局相关。相反，在男性AD患者中，炎症生物标志物（IL-6, IL-18, Jag-1）水平显著升高并与认知衰退相关。这些发现强调了在AD中存在性别差异易感性，nEVs衍生的生物标志物能够捕捉到性别特异性的脆弱性模式。
3.8. 鉴定用于区分AD与对照组受试者的最小nEVs衍生生物标志物组合
通过Lasso逻辑回归分析，研究人员确定了一个最小预测组合，包括四个nEVs衍生的生物标志物（较低的GDF-11，以及较高的GDF-15、Jag-1和Leptin），结合年龄和性别因素，能够有效区分AD患者与对照组。该组合的聚类分析显示轮廓系数较高，逻辑回归模型也显示出一定的预测能力。最重要的预测因子是GDF-15、性别、Leptin和Jag-1。
3.9. nEVs衍生的生物标志物组合在血浆中显示出有限的判别性能
当对血浆生物标志物数据进行相同分析时，所建立的模型分类性能有限，表明相同的生物标志物组合在血浆中区分AD和对照组的能力较差，这凸显了nEVs富集在捕捉大脑相关分子特征方面的附加价值。
3.10. 死后脑生物标志物显示有限的聚类但与nEVs在关键预测因子上趋同
对死后脑组织的分析虽然聚类效果不如nEVs明显，但同样识别出了一些有意义的预测因子（如GDF-11, GDF-15, Jag-1, 年龄）来区分对照组与MCI或AD。这与nEVs中的发现相吻合，加强了这些生物标志物的生物学意义。
3.11. 认知正常受试者亚组中血浆和nEVs的衰老生物标志物与大脑结构改变相关
在一小部分有MRI数据的认知正常参与者中，相关性分析揭示了nEVs中衰老相关生物标志物与AD典型受累脑区（如内嗅皮层、中下颞回、海马子区）的结构性脑改变之间存在稳健且生物学上一致的关联。构成最小预测组合的四个生物标志物（GDF-11, GDF-15, Jag-1, Leptin）均显示出与大脑结构指标的显著相关性，且这些关联在nEVs中比在血浆中更强、更具解剖学特异性。
本研究得出结论，nEVs是追踪脑衰老和AD进展的强大且具有生物学特异性的外周生物标志物来源。 across all analytical domains, including age, sex, cognitive function, and MRI, nEV-derived biomarkers consistently outperformed plasma-derived measures, confirming their closer link to central nervous system processes. 研究人员成功鉴定出一个由nEVs衍生的最小生物标志物组合（GDF-11, GDF-15, Jag-1, Leptin），在调整年龄和性别后，能够有效区分AD与认知正常对照。该组合反映了代谢调节、神经炎症、神经血管完整性和神经可塑性等多个生物学过程的相互作用，这些过程的协同破坏加速了脑衰老并 predisposes to AD。重要的是，nEVs中的生物标志物变化显示了性别特异性模式，并能在认知正常个体中捕捉到与早期脑结构改变相关的信号，提示其用于AD早期风险识别的潜力。相比之下，血浆中的相同生物标志物判别性能有限。
该研究的发现具有重要的转化价值。nEVs有潜力作为大脑的“液体活检”工具，通过非侵入性的血液检测来监测大脑内部的分子事件。将nEVs生物标志物与现有的AD生物标志物（如Aβ、p-tau）和神经影像学结合，有望提高AD早期诊断、风险分层和疾病进展监测的准确性，并有助于开发针对不同性别或分子亚型的精准预防与治疗策略。未来的研究需要在更大规模、纵向随访的队列中验证这些发现，并进一步探索nEVs在临床试验中的应用前景。
