NAC转录因子调控Ca2+和Zn2+依赖性核酸酶协同参与柑橘果实分泌囊细胞程序性死亡核降解的机制研究

《Scientia Horticulturae》：NAC transcription factors regulate Ca2+ -dependent and Zn2+ -dependent nucleases to cooperatively participate in nuclear DNA degradation during programmed cell death in secretory cavity cells of Citrus fruits

本研究揭示了柑橘果实分泌囊发育过程中，NAC转录因子通过时序性调控Ca2+依赖性核酸酶CrCAN和Zn2+依赖性核酸酶CrENDO1的表达，协同完成程序性细胞死亡（PCD）核DNA降解的分子机制。研究人员通过酵母单杂交、双荧光素酶报告基因等技术，发现CrNAC2负调控CrCAN介导早期有限DNA切割，而CrNAC87-like和CrNAC100正调控CrENDO1介导后期完全降解，为植物发育性PCD调控网络提供了新见解。

　　

在植物生长发育过程中，程序性细胞死亡（PCD）是一种由基因精确调控的细胞主动消亡过程，它既参与器官形态建成、组织分化等正常发育事件，也响应生物与非生物胁迫。其中，细胞核的降解是PCD最关键的标志性事件之一，而这一过程需要多种核酸酶的协同作用。早在2000年，科学家Sugiyama就提出假设：在植物PCD中，钙离子（Ca²⁺）依赖性核酸酶和锌离子（Zn²⁺）依赖性核酸酶可能以协同方式参与核DNA的降解。然而，二十多年来，调控这两类核酸酶协同作用的关键转录因子及其分子机制一直未被阐明。

柑橘类果实的分泌囊是合成和储存药用活性成分的重要场所，其发育过程伴随着典型的PCD事件，已成为研究植物发育性PCD的理想模型。前期研究表明，在柑橘分泌囊细胞PCD过程中，Ca²⁺依赖性核酸酶CrCAN首先进入细胞核，依赖Ca²⁺启动DNA的有限降解；随后，Zn²⁺依赖性核酸酶CrENDO1从液泡中释放，依赖Zn²⁺完成核DNA的完全降解。这两种核酸酶的时序性激活与协同作用构成了核降解的核心环节，但调控这一过程的“上游指挥者”——转录因子——仍属未知。

为解决这一科学问题，广东第二师范学院的吴虹团队在《Scientia Horticulturae》上发表了最新研究成果。研究以柑橘品种‘茶枝柑’为材料，聚焦其果实分泌囊发育过程中的PCD事件，首次揭示了NAC转录因子家族成员CrNAC2、CrNAC87-like和CrNAC100通过精确调控CrCAN和CrENDO1的表达，介导核DNA有序降解的分子通路。

研究主要采用了免疫胶体金定位、实时荧光定量PCR、原位杂交、亚细胞定位、酵母单杂交和双荧光素酶报告基因等关键技术方法。样本来源于广东江门新会区的8-9年生‘茶枝柑’果树的花和果实。

3.1. CrCAN和CrENDO1在分泌囊细胞PCD过程中协同参与核降解

通过免疫胶体金技术精确示踪了CrCAN和CrENDO1蛋白在分泌囊发育关键时期的时空分布。发现在分泌囊发育的中期原始细胞阶段，CrCAN大量聚集于细胞核内（染色质、核仁和核质），启动早期DNA有限降解；到晚期原始细胞阶段和腔道形成阶段，CrENDO1在细胞核和液泡中大量积累，执行DNA完全降解任务。这一结果从蛋白水平证实了两类核酸酶的协同作用模式。

3.2. 候选NAC转录因子的筛选及其在分泌囊发育中的参与

基于转录组数据筛选出三个与核降解过程表达谱相关的NAC转录因子CrNAC2、CrNAC87-like和CrNAC100。表达模式分析显示：CrNAC2在中期原始细胞阶段特异性高表达；CrNAC87-like在中期至腔道形成阶段高表达；CrNAC100则在晚期原始细胞和腔道形成阶段表达最高。原位杂交证实三者均特异表达于分泌囊细胞，且其表达峰值与核降解关键期高度吻合。

3.3. NAC转录因子通过调控核酸酶表达参与分泌囊形成

亚细胞定位证实三个转录因子均定位于细胞核。酵母单杂交和双荧光素酶实验表明：CrNAC2可直接结合CrCAN启动子并抑制其转录；而CrNAC87-like和CrNAC100能结合CrENDO1启动子并显著增强其表达。由此构建出清晰的调控通路：在分泌囊细胞PCD早期，CrNAC2通过负调控CrCAN防止DNA过早过度降解；在PCD中后期，CrNAC87-like和CrNAC100激活CrENDO1表达，确保DNA被彻底降解。

本研究首次在植物中建立了“NAC-CrCAN/CrENDO1”调控模型，揭示了NAC转录因子通过时序性调控不同金属离子依赖性核酸酶，精确指导PCD过程中核DNA有序降解的分子机制。该模型不仅深化了对植物发育性PCD调控网络的理解，也为改良柑橘果实品质（如分泌囊活性成分积累）提供了潜在靶点。研究结果填补了植物PCD研究中转录因子调控核酸酶协同作用的空白，为其他作物中类似机制的研究提供了重要参考。