综述：基于生物传感器的甲基化检测技术研究进展

《Sensors and Actuators Reports》：Biosensors for Epigenetic Biomarker Detection: Recent Advances and Perspectives

本综述系统梳理了电化学、电化学发光、光电化学、荧光、表面等离子体共振、表面增强拉曼散射及比色法等生物传感技术在DNA、RNA及蛋白质甲基化检测中的最新应用。文章重点阐述了各类传感器的设计原理、信号放大策略（如CRISPR/Cas系统、杂交链式反应、滚环扩增等）及其在癌症早期诊断、表观遗传学研究和新药筛选中的巨大潜力。专业术语标注清晰（如5-甲基胞嘧啶（5mC）、N6-甲基腺苷（m6A）），为从事生物标志物检测和精准医疗的研究人员提供了重要的技术参考和前沿动态。

　　

甲基化作为一种关键的表观遗传修饰，在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育以及疾病发生发展中扮演着至关重要的角色。DNA甲基化、RNA甲基化以及蛋白质甲基化的异常与多种人类疾病，尤其是癌症的发生、发展及预后密切相关。因此，发展高灵敏、高特异性、快速、低成本的甲基化检测技术对于基础生物学研究、临床诊断和药物开发具有极其重要的意义。近年来，各种生物传感技术因其独特的优势在甲基化检测领域展现出巨大的应用潜力。

电化学（EC）生物传感器

电化学生物传感器通过测量生物识别事件（如抗原-抗体结合、DNA杂交）引起的电信号变化来实现目标物的检测，具有灵敏度高、操作简便、成本低、易于微型化等优点，非常适合用于现场快速检测（POCT）。

在DNA甲基化检测方面，研究者们设计了多种巧妙的策略。例如，Bao等人构建了基于金纳米颗粒/还原氧化石墨烯/石墨相氮化碳（AuNPs/rGO/g-C₃N₄）纳米复合材料的电化学传感器，用于检测甲基化DNA。该传感器利用抗5-甲基胞嘧啶抗体特异性识别目标DNA中的甲基化胞嘧啶，从而产生电信号变化，实现了对甲基化DNA的高灵敏检测。Zhang等人则开发了一种基于链置换和肽核酸（PNA）侵入的高选择性传感器，无需亚硫酸氢盐处理或PCR扩增，即可在60分钟内完成检测，检测限低至0.075 pM。为了提高灵敏度，多种信号放大技术被引入，如杂交链式反应（HCR）、催化发夹组装（CHA）、链置换聚合（SDP）、指数扩增反应（EXPAR）以及CRISPR/Cas系统。例如，Chen等人将CRISPR/Cas12a的反式切割活性与电化学检测相结合，用于检测Dam甲基转移酶（MTase）活性，实现了极高的灵敏度。

对于RNA甲基化的检测，特别是N6-甲基腺苷（m6A），电化学生物传感器也取得了显著进展。Guo等人利用激光诱导石墨烯（LIG）电极构建了传感器，通过β-环糊精（β-CD）电聚合固定抗体，实现了对m6A的高灵敏度检测。Li等人则设计了基于DNAzyme的传感器，利用其构象变化来特异性识别m6A位点。

电化学发光（ECL）与光电化学（PEC）生物传感器

ECL和PEC生物传感器结合了化学发光/光化学的灵敏度和电化学控制的优点，通常具有极低的背景信号和高的信噪比。

ECL生物传感器通常使用钌联吡啶（Ru(bpy)₃²⁺）或其衍生物、量子点等作为发光体。Lin等人构建了一种双信号增强的ECL生物传感器，利用CRISPR/Cas12a的反式切割活性来检测Dam MTase活性。当目标存在时，CRISPR/Cas12a被激活，切割淬灭剂标记的DNA探针，导致ECL信号恢复。Lv等人开发了一种比率型ECL纸基平台，利用两种发光体（功能化纳米簇和碳量子点）信号的比值变化来实现对DNA甲基化的准确、灵敏分析，检测限低至0.27 fM。

PEC生物传感器使用光作为激发源，电信号作为读出，实现了激发与检测信号的分离，有助于降低背景干扰。Zhu等人报道了一种基于g-C₃N₄@TiO₂共敏化和桥连DNA纳米探针的PEC传感器，用于超灵敏检测DNA 5-mC。Li等人则利用苝基聚合物（PTC-NH₂）优异的光电性能，构建了红光驱动的PEC传感器，结合靶标引发的杂交链式反应（HCR）信号放大，实现了对Dam MTase的超灵敏检测。

荧光生物传感器

荧光生物传感器以其高灵敏度、可视化和多重检测能力而备受青睐。其原理通常涉及荧光共振能量转移（FRET）、聚集诱导发光（AIE）或基于纳米材料的信号调制。

在DNA甲基化检测中，Zhang等人设计了一种基于氧化损伤碱基（8-氧代鸟嘌呤，8-oxoG）的荧光探针。在人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖苷酶1（hOGG1）存在下，该探针可被甲基化DNA触发发生循环切割，产生放大的荧光信号，无需亚硫酸盐处理或扩增即可直接检测DNA甲基化。Sun等人则利用指数扩增反应（EXPAR）启动的CRISPR/Cas12a（EIC）策略，实现了对DNA MTase活性的超灵敏荧光检测。

对于RNA m6A的检测，多种放大策略被应用。Wang等人开发了基于金属有机凝胶（MOG）的ECL生物传感器，可同时检测m6A及其氧化衍生物。Hu等人则将外源核酸（XNA）探针与CRISPR/Cas13a系统结合，实现了位点特异性m6A的高灵敏荧光检测。

表面等离子体共振（SPR）与表面增强拉曼散射（SERS）生物传感器

SPR生物传感器是一种无标记技术，通过检测生物分子结合引起的折射率变化来进行实时、定量分析。Xia等人利用p53蛋白与甲基化DNA共识序列的特异性结合，构建了SPR传感器用于实时监测DNA MTase活性及其抑制剂筛选。

SERS技术通过将待测分子吸附在粗糙的金属表面，可使其拉曼信号增强数百万倍，从而实现单分子水平的检测。Luo等人设计了一种等离激元金纳米孔阵列作为SERS基底，用于无标记检测DNA甲基化。通过分析胞嘧啶环呼吸振动峰强度的变化，可以灵敏地反映甲基化水平。Alom等人报道了一种简单的基于金纳米颗粒聚集的SERS方法，通过分析1350 cm^-1处的拉曼峰（对应于5mC的甲基振动）来读取全局DNA甲基化水平。SERS技术还能用于区分不同的甲基化形式（如5mC, 5hmC, 5fC, 5caC），并跟踪其动态转化过程。

比色生物传感器

比色法因其操作简单、结果可通过肉眼判读而非常适合POCT应用。Yuan等人开发了一种基于引物交换反应（PER）和功能化血红蛋白/G-四链体DNA酶（FHGD）的比色生物传感器用于检测DNA MTase活性。该传感器将MTase活性转化为过氧化物酶模拟活性，催化底物产生颜色变化，实现了可视化检测。

总结与展望

各类生物传感技术为甲基化检测提供了强大而多样的工具。电化学和电化学发光传感器在灵敏度和便携性方面优势突出；荧光传感器适用于高灵敏度和多重检测；SPR适用于实时、无标记相互作用研究；SERS提供独特的分子指纹信息；而比色法则在简易性和现场检测方面潜力巨大。

未来的发展趋势包括：1）开发新型纳米材料和信号探针以进一步提高灵敏度和稳定性；2）整合多种检测模式（如ECL与SERS结合）以实现多重检测和相互验证；3）推动传感器向微型化、集成化、自动化方向发展，实现真正的POCT应用；4）扩大其在临床样本（如血清、组织、循环肿瘤DNA）中的验证和应用，加速其向临床诊断的转化。随着技术的不断进步和创新，生物传感器必将在揭示表观遗传调控机制、疾病早期诊断、预后评估以及个性化治疗中发挥越来越重要的作用。