《Food Analytical Methods》：A Rapid and Semi-automated Method for the Quantitation of Chitin in the Basidiomycetes Lentinus squarrosulus and Pleurotus ostreatus
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为解决食用真菌发酵食品工业副产物过程中生物量难以准确量化的问题，研究人员比较了改良的Smith和Gilkerson光度法与基于凯氏定氮的半自动化方法（Fibretherm）在定量平菇（Pleurotus ostreatus）子实体和糙皮侧耳（Lentinus squarrosulus）菌丝体几丁质含量的适用性。结果表明，两种方法在真菌含量高于20-40%时结果高度一致，且半自动化方法避免了有毒化学品的使用，为真菌发酵产品的质量控制提供了更安全、高效的解决方案。
在全球范围内，食品工业每年产生大量不溶于水的副产物，如甜菜粕和糖蜜，这些富含粗纤维但缺乏游离糖的物料传统上难以被微生物有效利用。食用担子菌（Basidiomycota）因其能分泌多种酶降解这些副产物而成为升级循环（upcycling）的理想候选。然而，在发酵结束后，残余的副产物与真菌菌丝体混杂，如何准确量化真菌生物量以评估发酵效率成为技术瓶颈。当前，以几丁质（chitin）作为标志物进行定量的方法多依赖于操作繁琐、需使用有毒化学品的传统光度法。因此，开发一种快速、安全且可靠的替代方法对于推动真菌发酵技术在食品工业副产物增值化应用至关重要。本研究旨在评估一种新近开发的、基于碱性蛋白水解和凯氏定氮（Kjeldahl method）的半自动化方法（Fibretherm法）在定量两种典型担子菌——糙皮侧耳（Lentinus squarrosulus）菌丝体和平菇（Pleurotus ostreatus）子实体中几丁质含量的可行性，并与经典的Smith和 Gilkerson光度法进行比较。相关研究成果发表于《Food Analytical Methods》。
本研究采用了几项关键技术方法：1）样品制备：包括糙皮侧耳菌丝体的深层培养（使用麦芽提取物培养基或甜菜粕-糖蜜培养基）、平菇子实体的采集、样品的冷冻干燥和研磨；2）光度法测定几丁质：基于Smith和Gilkerson法并经过Vetter和Siller以及Ahlborn等人改良，涉及盐酸水解、脱乙酰化、脱氨基反应，以及与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐（MBTH）的显色反应，在650 nm波长下进行光度测量；3）半自动化Fibretherm法：使用Fibretherm系统进行碱性蛋白水解，去除可溶性蛋白和氨基酸后，对残留物（主要含几丁质）进行凯氏定氮分析，通过氮含量计算几丁质含量；4）氨基酸分析：使用氨基酸分析仪验证碱性水解后残留的氨基酸氮含量，以确保Fibretherm法的特异性；5）统计分析：采用双因素方差分析（ANOVA）与Bonferroni校正等进行数据显著性检验。
材料与方法
研究人员选取了平菇子实体和糙皮侧耳菌丝体作为研究对象，并将其与红薯粉按不同比例混合，以模拟不同真菌含量的发酵样品。分别采用改良的Smith和Gilkerson光度法和半自动化Fibretherm法对这些已知组成的混合物进行几丁质定量分析，并将测定值与理论计算值进行比较。此外，还对在甜菜粕-糖蜜培养基中发酵6天获得的糙皮侧耳发酵样品进行了两种方法的对比验证，部分Fibretherm分析由设备制造商C. Gerhardt进行外部验证。
结果与讨论
平菇（P. ostreatus）子实体的分析：对于平菇子实体与红薯粉的混合物，光度法测得的几丁质含量（3.6 ± 0.1% DM）略高于Fibretherm法（3.0 ± 0.0% DM），但均在文献报道范围（约2.1-5.5% DM）内。光度法的略微高估可能源于基质中某些氨基酸（如L-色氨酸、L-苏氨酸、L-蛋氨酸）与MBTH的潜在干扰反应。计算得到的真菌含量与目标值在两种方法间无显著差异，但Fibretherm法在真菌含量低于20%时出现高估和较大标准偏差，表明其在该区间的定量可靠性受限。
糙皮侧耳（L. squarrosulus）菌丝体的分析：对糙皮侧耳菌丝体与红薯粉的混合物，两种方法测得的几丁质含量高度一致（光度法：4.67 ± 0.03% DM；Fibretherm法：4.83 ± 0.09% DM），且与相近物种的文献值相符。计算出的真菌含量在两种方法间也无显著差异。同样，Fibretherm法在低真菌含量（0-20%）区间再次表现出较高的变异性和高估倾向。
生物反应器样品的分析：对实际发酵获得的糙皮侧耳菌丝体样品进行分析，光度法、自行操作的Fibretherm法以及设备商操作的Fibretherm法所计算出的真菌含量高度一致，且无统计学显著差异。这证实了Fibretherm法在实际发酵样品分析中的适用性，特别是在真菌含量较高（>40%）时。
方法比较：在分析时间和成本方面，Fibretherm法虽然单个样品的化学品消耗成本（约3欧元）高于光度法（约0.5欧元），但其自动化程度高，显著减少了人工操作时间。对于40个样品，Fibretherm法需约2天，而光度法则需3天。因此，在考虑人员成本后，Fibretherm法在常规分析中可能更具成本效益，尤其适合处理大批量样品。
结论与意义
本研究表明，半自动化Fibretherm法与传统的Smith和Gilkerson光度法在定量担子菌（平菇子实体和糙皮侧耳菌丝体）几丁质含量方面，当样品中真菌含量高于20-40%时，具有高度可比性和良好的重现性。Fibretherm法的主要优势在于避免了有毒化学品的使用，自动化程度高，降低了人为误差和操作人员风险。其局限性在于对低真菌含量（<20%）样品定量准确性稍差，且所需样品量较大（0.8-1.0 g）。尽管如此，对于真菌发酵工业中常见的、真菌生物量占比较高的发酵产物质量监控而言，半自动化Fibretherm法提供了一种安全、可靠且高效的替代方案，有望在相关领域的常规分析中取代传统的光度法，促进食品工业副产物通过真菌发酵实现增值利用的进程。
