《iScience》：Impact of Tau overexpression on DNA replication dynamics in centromeres of human neural progenitor cells
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本研究针对阿尔茨海默病（AD）中染色体Y（ChrY）和21（Chr21）特异性非整倍性增高的现象，探讨了Tau蛋白过表达对其着丝粒区DNA复制动态的影响。研究人员利用人神经祖细胞模型，结合单分子DNA复制分析（SMARD）与新生链测序（NS-seq），发现野生型（wt）与拟磷酸化（php）Tau通过差异调控复制起点（ORI）激活与复制叉暂停，破坏着丝粒α-卫星DNA复制完整性。质谱分析进一步揭示php Tau核内互作蛋白减少，影响染色质重塑与运输。该研究为理解Tau病理背景下基因组不稳定性提供了单分子水平的机制见解，发表于《iScience》。
随着年龄增长，体细胞中特定染色体的非整倍性（染色体数目异常）现象逐渐增多，尤其在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）患者中，染色体Y（ChrY）丢失和染色体21（Chr21）三体尤为常见。这些染色体异常被认为是AD病理的驱动因素之一，但其分子机制尚不明确。着丝粒作为染色体分离的关键结构，其DNA主要由高度重复的α-卫星序列构成，在复制过程中极易发生错误。与此同时，微管相关蛋白Tau在AD患者脑内异常聚集，并被发现可进入细胞核与DNA相互作用。那么，Tau的异常表达是否会干扰着丝粒的复制，进而导致染色体错误分离？这项发表于《iScience》的研究给出了答案。
为了回答这一问题，研究团队首先构建了可诱导表达野生型Tau（wt Tau）或拟磷酸化Tau（php Tau）的人神经祖细胞（NPC）模型。通过单分子DNA复制分析（SMARD）与长读长测序技术，他们首次实现了对ChrY和Chr21着丝粒区α-卫星DNA复制动态的单分子、单倍型级别解析。研究发现，在正常细胞中，复制起点（ORI）和复制叉暂停事件主要富集于α-卫星区域。而过表达wt Tau或php Tau后，两个着丝粒区的复制动态出现显著差异：php Tau过表达导致ChrY着丝粒区复制叉暂停增加，并激活补偿性ORI以缓解复制压力；而在Chr21着丝粒区，php Tau则削弱了固有ORI的活性，并引起侧翼序列复制受阻。新生链测序（NS-seq）进一步从群体水平证实，Tau过表达会全局性降低复制起始频率，尤其在α-卫星区域更为明显。后续的蛋白质组学分析表明，php Tau在核内的相互作用蛋白数量减少，且与染色质重塑和细胞内运输相关的通路受到影响，提示其可能通过改变核内蛋白互作网络而间接影响复制过程。
关键实验方法概述
研究利用来自健康男性捐赠者的皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC），并分化为神经祖细胞（NPC），进而通过慢病毒转染构建可诱导表达wt Tau或php Tau的等基因细胞系。核心技术支持包括：PacBio HiFi和牛津纳米孔（ONT）长读长测序完成着丝粒区完整组装；单分子DNA复制分析（SMARD）可视化单个DNA分子上的复制起点、叉行进方向与终止位点；新生链测序（NS-seq）全基因组定量检测复制起始位点；基于免疫沉淀的质谱分析鉴定Tau核内互作蛋白。
主要研究结果
神经祖细胞过表达Tau
研究成功建立了可调控表达Tau蛋白的NPC模型，并通过免疫印迹与免疫荧光验证了Tau表达及细胞干性标志物（如Sox2、Nestin）的表达。
长读长测序耦合SMARD分析特定染色体及等位基因的α-卫星
通过PacBio HiFi与ONT测序，研究人员完成了ChrY和Chr21着丝粒区的单倍型级别组装，并利用SMARD技术对这两个着丝粒区的复制动态进行单分子分析。结果显示，ChrY着丝粒SMARD分子（经KpnI酶切后为570 kbp）包含384 kbp的α-卫星阵列；Chr21着丝粒单倍型2的SMARD分子（经BamHI酶切后为1.06 Mbp）包含846 kbp的α-卫星序列。这些长分子为高分辨率复制分析提供了结构基础。
ChrY α-卫星处的复制叉暂停及php Tau过表达下的补偿性ORI激活
在ChrY着丝粒区，正常细胞已在α-卫星区内约120 kbp处（bin 4）出现复制叉暂停簇。wt Tau过表达使暂停位点扩展至~150 kbp（bin 5），而php Tau过表达则进一步加剧了bin 4处的暂停，并激活了多个补偿性ORI（如bin 4、9、13）。这表明php Tau通过启动更多ORI来应对复制压力。
过表达php Tau破坏cen21侧翼区的复制叉行进
在Chr21着丝粒区，php Tau过表达不仅减少了α-卫星区内固有ORI的利用率，还导致侧翼序列复制受阻，提示其复制完整性受损。
重复序列富集于活性ORI
作为对照，研究还分析了核糖体DNA（rDNA）重复单元的复制，发现其启动也集中于前三个重复单元，进一步证实重复序列具有特定的复制起始模式。
Tau过表达降低全局及着丝粒复制活性
NS-seq分析表明，Tau过表达使全基因组范围内活性ORI数量减少20%–25%，且着丝粒区ORI利用率显著降低，与SMARD结果相互印证。
Tau及其互作蛋白的蛋白质组学分析
质谱分析显示，与wt Tau相比，php Tau在核内互作的蛋白数量更少，且与染色质重塑和细胞内运输相关的功能通路富集程度下降，提示php Tau可能因其构象改变而削弱了与核内蛋白的相互作用。
研究结论与意义
本研究系统揭示了Tau蛋白过表达如何通过干扰着丝粒区DNA复制动力学，进而促进AD相关特异性染色体非整倍性的分子机制。特别是php Tau，通过改变复制起点使用模式、诱发复制叉暂停、以及破坏核内蛋白互作网络，显著增加了基因组不稳定性。该研究不仅为理解Tau蛋白在AD中的非经典功能（如调控DNA复制）提供了直接证据，也为早期干预AD相关的染色体异常提供了潜在靶点。综合运用SMARD、长读长测序、NS-seq及蛋白质组学等多组学技术，该研究在单分子水平深化了对着丝粒复制脆弱性与神经退行性疾病关联的认知。
