《Plant Communications》：The TaDof-2D-miR1832-TaP450-7A module regulates low temperature-induced release of seed dormancy in wheat
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本研究针对低温诱导小麦种子休眠释放的调控机制不明确问题，通过全转录组测序技术发现关键miR1832及其上下游通路。研究人员系统解析了TaDof-2D通过结合miR1832启动子A位点抑制其转录，进而解除对靶基因TaP450-7A的调控，最终通过影响α-淀粉酶活性及ABA/GA途径介导休眠释放的分子通路。该研究不仅揭示了低温信号转导的新机制，开发的CAPS标记1832更为抗穗发芽小麦育种提供了重要遗传资源。
在小麦生产中，穗发芽（Pre-harvest Sprouting, PHS）是严重影响粮食质量和产量的全球性问题。当成熟期遭遇阴雨天气时，籽粒在穗上提前萌发会导致淀粉降解、加工品质下降，造成重大经济损失。种子休眠（Seed Dormancy, SD）作为抑制穗发芽的关键性状，其强度需要精确平衡——过强休眠会影响出苗率，过弱休眠则易引发穗发芽。有趣的是，自然界中存在一种适应性机制：小麦种子在发育中后期经历低温（Low Temperature, LT）环境后，休眠水平会显著降低。这种低温诱导的休眠释放现象虽早有记载，但其背后的分子调控网络数十年来始终是未解之谜。
为揭开这一谜题，研究团队在《Plant Communications》发表的研究中，采用多组学整合分析策略，首次绘制出小麦低温信号转导的完整通路图谱。通过全转录组测序（whole-transcriptome sequencing）技术，研究人员从低温处理的种子中筛选到一个关键节点——微RNA1832（miR1832），其表达量随低温处理显著下调。通过创制过表达和基因沉默株系，研究团队在表型层面验证了miR1832的功能：过表达株系种子休眠增强，而沉默株系休眠减弱，明确其负向调控休眠的角色定位。
进一步溯源调控机制时，研究者在miR1832启动子区发现了一个关键单核苷酸多态性（SNP）位点（-670 bp处的A/G突变）。群体遗传学分析显示，该突变与不同小麦品种的休眠强度显著相关，A基因型对应强休眠表型。通过酵母单杂交（Yeast One-Hybrid, Y1H）、凝胶阻滞实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）及双荧光素酶报告基因（Dual-Luciferase, LUC） assay三重验证，研究团队锁定了一个低温响应型Dof转录因子TaDof-2D可直接结合启动子区的A基因型位点，从而抑制miR1832转录。
在下游靶标挖掘中，研究通过双荧光素酶报告系统与5'-cDNA末端快速扩增（5'-RACE）技术证实，miR1832能够特异性切割细胞色素P450基因TaP450-7A的转录本。该基因在低温环境下表达上调，且功能实验表明其具有促进休眠释放的作用。至此，一条完整的信号通路浮出水面：低温通过激活TaDof-2D表达，抑制miR1832转录，解除其对TaP450-7A的抑制作用，最终触发休眠释放。
在机制深入解析层面，生理生化数据表明该模块通过协调激素平衡调控休眠状态：低温处理下，TaP450-7A的上调伴随脱落酸（Abscisic Acid, ABA）含量下降与赤霉素（Gibberellin, GA）水平上升，同时α-淀粉酶活性显著增强。这一系列变化共同构建了种子从休眠向萌发转换的生理基础。
关键技术方法
研究整合多组学与分子生物学技术：通过全转录组测序筛选低温响应基因；利用群体遗传学分析启动子区SNP与表型关联；采用Y1H、EMSA和双荧光素酶报告系统验证转录调控关系；通过5'-RACE技术确定miRNA切割位点；结合激素检测与酶活分析解析生理机制。实验材料涵盖多种小麦栽培品种。
TaDof-2D识别miR1832启动子顺式元件
通过Y1H筛选发现TaDof-2D可与miR1832启动子互作，EMSA实验证实其特异性结合A基因型位点，LUC报告系统显示TaDof-2D过表达使启动子活性下降70%，表明其作为转录抑制子发挥作用。
miR1832靶向调控TaP450-7A基因表达
双荧光素酶实验显示miR1832可使TaP450-7A报告载体活性降低50%，5'-RACE在TaP450-7A转录本第10-11位核苷酸间鉴定到精确切割位点，证实二者存在直接靶向关系。
分子模块调控激素通路与酶活系统
低温处理下，TaP450-7A过表达株系ABA含量下降42%、GA3水平上升2.3倍，α-淀粉酶活性增强3.1倍，说明该模块通过协调激素平衡与代谢活性调控休眠状态。
讨论与展望
该研究首次揭示的TaDof-2D–miR1832–TaP450-7A模块，不仅完善了植物温度信号转导理论，更为解决穗发芽这一重大农业问题提供了双路径策略：基于启动子A基因型的CAPS标记1832可实现抗性品种快速选育；操纵关键基因表达强度则可精准调控休眠深度。值得注意的是，该模块中TaP450-7A可能通过催化油菜素内酯等激素代谢物间接影响ABA/GA平衡，这为后续解析P450家族蛋白功能提供了新方向。随着气候变暖导致极端天气频发，该项研究成果对于培育适应波动气候的智能型小麦品种具有重要战略意义。
