CD38通过维持IL-2受体高亲和力赋予中枢神经系统驻留Treg细胞应激耐受性以控制区室化炎症

《Nature Immunology》：CD38 endows local antigen-specific Treg cells with stress resilience for control of compartmentalized CNS inflammation

本研究揭示了在多发性硬化症小鼠模型中，CD38+Foxp3+ Treg细胞在炎症后中枢神经系统（CNS）组织中持续存在并维持免疫稳态的机制。这些定位于CNS的应激耐受性Treg细胞通过表达CD38，利用其NAD+水解酶活性，拮抗IL-2受体α亚基（CD25）的ADP-核糖基化，从而在IL-2受限的应激微环境中维持高亲和力IL-2信号传导，确保抗原特异性Treg细胞的存活与功能，防止CNS自身免疫炎症复发。

　　

在多发性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）等慢性中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）自身免疫性疾病中，急性炎症消退后，如何长期维持局部免疫稳态、防止疾病复发，是神经免疫学领域亟待解决的关键科学问题。传统观点认为，急性期过后，炎症浸润会大幅消退。然而，近年研究发现，即使在临床恢复期，CNS内仍存在一个独特的免疫细胞生态位，其中Foxp3+调节性T细胞（Regulatory T cells, Treg）扮演着至关重要的“免疫审计官”角色。但这些Treg细胞如何在炎症消退后、营养因子（如白细胞介素-2, Interleukin-2, IL-2）匮乏且富含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NAD+）的“恶劣”CNS微环境中长期存活并行使功能，其分子机制尚不明确。这限制了靶向Treg细胞治疗慢性CNS炎症策略的发展。

为解决这一难题，一项发表于《Nature Immunology》的研究深入探究了炎症后CNS中Treg细胞的持久存留机制及其功能重要性。研究人员利用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein, MOG）_35-55肽段诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE）小鼠模型，该模型能模拟MS的急性发作和慢性恢复过程。研究发现，在EAE急性期过后，尽管大多数炎性浸润细胞（包括常规T细胞, T conventional, T_conv）数量显著减少，但一群Foxp3+ Treg细胞却在CNS（包括脑和脊髓）中持久驻留，其局部频率反而相对增加。通过先进的细胞追踪技术（如光转换标记表达线粒体Dendra2的T细胞）和体内增殖检测（如EdU掺入），研究证实恢复期CNS中的Treg细胞池基本与系统免疫区室隔离，并具有一定的自我更新能力，而非依赖于从外周持续招募。

为了验证这群“炎症经历”的CNS Treg细胞的功能必要性，研究人员巧妙地使用了表达白喉毒素受体（Diphtheria Toxin Receptor, DTR）的Foxp3-DTR小鼠模型。在EAE恢复期，通过立体定向技术向脑室内（intracerebroventricular, i.c.v.）微量注射白喉毒素（Diphtheria Toxin, DTx），可特异性且高效地清除CNS局部的Treg细胞，而全身性Treg细胞仅受到轻微影响。令人惊讶的是，这种局部Treg细胞的清除迅速诱发了EAE病情的严重复发，表现为后肢瘫痪等症状再现。组织学分析显示，复发伴随着CNS内CD4+ T细胞（尤其是活化的CD69+ T细胞）数量的急剧增加和炎症病灶的重新激活。重要的是，即使使用FTY720（一种阻止淋巴细胞从淋巴组织向外迁移的药物）处理小鼠，阻断新的效应T细胞进入CNS，也无法阻止由局部Treg细胞缺失所引发的复发。这表明，残留在CNS内的效应T细胞足以在失去Treg细胞控制后驱动疾病复发，凸显了局部驻留Treg细胞在维持CNS免疫稳态中不可替代的作用。

那么，是什么赋予了这群CNS Treg细胞在“逆境”中生存的韧性？研究人员对从EAE高峰期和恢复期小鼠的CNS及脾脏中分选出的Treg细胞进行了转录组（RNA sequencing, RNA-seq）分析。结果发现，与高峰期或脾脏来源的Treg细胞相比，恢复期CNS Treg细胞表现出独特的基因表达特征，其中“IL-2-STAT5信号通路”显著富集。IL-2是Treg细胞存活和功能的关键细胞因子。在炎症消退后的CNS，IL-2的来源（主要活化的T_conv细胞）大幅减少，微环境中的IL-2水平极低。然而，恢复期CNS Treg细胞高表达IL-2受体α链（CD25），构成了高亲和力IL-2受体，使其能够高效地捕捉和利用微量的IL-2，从而在“饥饿”环境中得以存续。

进一步的机制探索将焦点集中于一个关键的分子——CD38。CD38是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，具有NAD+水解酶活性。研究发现，在炎症后CNS中持续存在的Treg细胞高表达CD38。有趣的是，细胞外的NAD+水平在炎症组织中升高，它可作为ADP-核糖基转移酶2.2（ARTC2.2）的底物，催化对T细胞表面蛋白（如P2X7受体、IL-2Rα等）的ADP-核糖基化修饰。这种修饰可能改变蛋白功能，例如，ADP-核糖基化的IL-2Rα会丧失与IL-2高亲和力结合的能力，进而削弱下游STAT5信号通路，最终威胁Treg细胞的生存。本研究的核心发现在于，Treg细胞自身表达的CD38通过消耗细胞膜附近的NAD+，直接对抗了ARTC2.2介导的ADP-核糖基化作用。具体而言，CD38缺陷（Cd38^-/-）的Treg细胞，其IL-2Rα更容易被NAD+诱导发生ADP-核糖基化，导致IL-2信号传导能力下降，STAT5磷酸化水平降低。在体内实验中，将MOG抗原激活的Cd38^-/-Treg细胞过继转移到Treg细胞已耗竭的EAE宿主小鼠体内，无法像野生型Treg细胞那样控制疾病进展。更重要的是，在混合骨髓嵌合体实验中，当通过局部DTx注射清除掉表达DTR的野生型Treg细胞后，残留的Cd38^-/-Treg细胞无法维持免疫稳态，导致EAE迅速复发，而残留的野生型Treg细胞则能有效控制病情。这些证据强有力地表明，CD38的表达是Treg细胞在炎症后CNS这一特定微环境中获得“应激耐受性”的细胞内在关键因素。

此外，研究还发现，CD38对于维持CNS内抗原特异性Treg细胞库至关重要。利用MOG_35-55-I-Ab四聚体技术，研究人员鉴定出能够识别疾病相关抗原的Treg细胞。结果显示，在恢复期CNS中，绝大多数MOG特异性的Treg细胞都位于CD38+群体内。在混合嵌合体模型中，与野生型Treg细胞相比，Cd38^-/-Treg细胞中抗原特异性群体的比例显著降低。这表明CD38的缺失特别影响了具有潜在更强抑制功能的抗原特异性Treg细胞的存活或扩增。

研究人员在开展此项研究时，综合运用了多种关键技术方法。核心动物模型为MOG_35-55诱导的EAE模型。细胞命运追踪采用了Cd4^Cre× Rosa26^{LSL-mitoDendra2}报告小鼠进行光转换标记，以及Foxp3^Cre-ERT2× Rosa26^LSL-tdTomato小鼠进行Treg细胞命运图谱分析。细胞特异性剔除则依赖Foxp3-DTR小鼠模型，并通过i.c.v.显微注射实现CNS局部Treg细胞清除。分子机制探索方面，使用了Cd38基因敲除（Cd38^-/-）小鼠，并通过体外NAD+处理、IL-2刺激以及流式细胞术检测STAT5磷酸化等手段，验证了CD38-NAD+-ARTC2.2-IL-2Rα信号轴的功能。细胞表型和转录组分析则通过高参数流式细胞术和批量RNA-seq完成。样本来源包括EAE小鼠的CNS、脾脏、淋巴结以及脂肪组织等。

T_regcells persist in the CNS after recovery from an autoimmune response

通过EAE模型证实，在炎症高峰期过后，T_conv细胞数量显著下降，而T_reg细胞在CNS中持续存在，频率相对增加。细胞追踪和增殖实验表明，恢复期CNS Treg细胞池主要源于局部存留，与系统循环隔离，并具有一定自我更新能力。

Stress-tolerant T_regcells control compartmentalized CNS inflammation

利用Foxp3-DTR模型进行CNS局部Treg细胞剔除，发现这会迅速导致EAE复发，伴有CNS内T细胞激活和炎症再现。即使阻断淋巴细胞入脑，复发仍发生，证明残留的CNS效应T细胞在失去Treg控制后足以驱动疾病。

Stress-tolerant CNS T_regcells have a tissue-type transcriptome

RNA-seq分析揭示，恢复期CNS Treg细胞具有独特的转录谱，富集于“IL-2-STAT5信号”和“应激反应”等相关通路，区别于高峰期CNS Treg细胞和稳态组织（如脂肪组织）Treg细胞。

Lack of CD38 impairs the regulatory capacity of CNS Foxp3⁺T_regcells

CD38在CNS Treg细胞中上调。Cd38^-/-Treg细胞过继转移不能控制EAE。机制上，CD38通过水解NAD+，防止ARTC2.2介导的IL-2Rα ADP-核糖基化，从而维持IL-2高亲和力信号及Treg细胞存活。

CD38 is crucial for maintenance of antigen-specific CNS T_regcells

MOG四聚体染色显示，恢复期CNS中绝大多数抗原特异性Treg细胞是CD38+。在混合嵌合体中，Cd38^-/-Treg细胞中抗原特异性群体比例低于野生型，表明CD38对维持抗原特异性Treg库至关重要。

Stress-tolerant CNS T_regcells are dependent on CD38 for sensing IL-2

体内实验表明，i.c.v.注射NAD+会选择性地诱导CNS Treg细胞凋亡，此效应可被ARTC2.2抑制性纳米抗体阻断。体外实验证实，Cd38^-/-Treg细胞的IL-2Rα更易被NAD+依赖性ADP-核糖基化，导致IL-2刺激下的STAT5磷酸化水平降低。

综上所述，本研究揭示了CD38是炎症后CNS中Treg细胞维持“应激耐受性”表型的一个核心决定因子。这些“应激耐受性”Treg细胞通过高表达CD38，主动调节局部NAD+代谢，保护其高亲和力IL-2受体免受失活修饰，从而在IL-2匮乏的微环境中“巧妙”地利用有限资源，确保自身存活并持续发挥免疫抑制功能。这不仅深化了对组织驻留Treg细胞适应性机制的理解，更重要的是，为治疗多发性硬化症等慢性CNS自身免疫性疾病提供了新的思路：增强或模拟CD38+ Treg细胞的功能，或直接靶向CD38-NAD+轴，可能成为促进CNS免疫稳态、防止疾病复发的潜在新策略。该研究强调了局部微环境代谢物与免疫细胞功能调节之间的精细互动，为免疫代谢研究开辟了新的视角。