《Nucleic Acids Research》：A new set of combinatorial dimeric codes for nuclear hormone receptor–target gene specificity
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本文报道了在线虫中发现一种新型组合式二聚化编码机制：核激素受体NHR-79与NHR-49通过异源二聚化识别并结合非经典反向重复序列GACTAC（IR3），从而特异性调控过氧化物酶体脂肪酸β-氧化及相关脂肪分解代谢基因的转录。该研究揭示了P-box基序的可塑性，为理解核激素受体-靶基因特异性提供了新见解。
在生命体中，核激素受体作为信号传导型转录因子，调控着至关重要的发育和生理过程。这类受体通常通过其DNA结合结构域识别特定的顺式作用元件，从而决定靶基因的特异性。长期以来，经典的AGGTCA重复序列及其不同方向与间距的组合（如DR0-5、IR、ER）被认为是多数核激素受体的识别模式。然而，这种有限的组合方式难以解释所有核激素受体与其靶基因之间的特异性识别，尤其是在拥有284个核激素受体的模式生物秀丽隐杆线虫中，其调控特异性问题尤为突出。
此前研究发现，线虫中的两个HNF4α核激素受体NHR-79和NHR-49共同调控包括acox-3、dhs-28在内的一系列过氧化物酶体脂肪酸β-氧化基因的转录，这些基因在脂肪分解和dauer信息素合成中发挥关键作用，并且其表达受到β-氧化产物的反馈抑制，从而维持脂肪代谢稳态。然而，介导这一调控过程的关键DNA响应元件一直未被阐明。
为了解决这一问题，研究人员开展了一项系统性研究，旨在精确鉴定NHR-79和NHR-49直接结合的顺式元件，并阐明其识别机制和生物学功能。该研究成功发现了一个全新的、由GACTAC构成的反向重复三碱基间隔序列，并证实NHR-79与NHR-49倾向于以异源二聚体的形式结合该元件，从而特异性激活下游脂肪分解代谢相关基因的转录。这项研究发表于《核酸研究》。
为开展研究，作者运用了多种关键技术方法：通过启动子逐段缺失和单核苷酸水平的点突变扫描，结合单拷贝转基因技术在线虫染色体特定位点整合报告基因，精确鉴定出关键的20 bp响应元件；利用凝胶阻滞迁移实验和GST pull-down技术，在体外验证了NHR-79和NHR-49蛋白与DNA元件的直接结合及其异源二聚化特性；采用尺寸排阻色谱分析了蛋白质-DNA复合物的组成和化学计量；通过实时荧光定量PCR检测了目标基因的mRNA表达水平；并利用油红O染色等技术在整体动物水平评估了脂肪储存和消耗的动态变化。研究涉及的动物样本为同步化培养的秀丽隐杆线虫。
研究结果
一个20 bp的顺式元件是过氧化物酶体β-氧化缺陷诱导转录上调所必需且充分的
研究人员通过系统性地缺失acox-3基因启动子区域，并结合单拷贝转基因和GFP报告系统，发现位于启动子-221 bp至-202 bp的一个20 bp序列（命名为元件de）对于响应β-氧化缺陷（如dhs-28突变）以及NHR-79/NHR-49的调控是必需且充分的。将该元件以四聚体形式串联至异源最小启动子pes-10p前，能够重现其在β-氧化突变体和NHR因子突变体中的转录调控模式。
元件de是一个不完美的GACTAC反向重复三碱基间隔序列，NHR-79以高亲和力和特异性结合其上
序列分析表明，元件de的核心是一个由3个碱基隔开的不完全反向重复序列，其序列为CACCACnnnGTAGTC（正义链），即GACTAC的IR3形式。EMSA实验证实，GST::NHR-79能够以高亲和力特异性结合该IR3元件，而破坏重复序列或改变间隔序列长度会显著削弱或消除结合。竞争实验表明，NHR-79对完美的GACTAC IR3（即ee元件）结合亲和力最高。
NHR-79和NHR-49主要通过LBDs以1:1化学计量异源二聚化
通过GST pull-down和凝胶过滤色谱实验，研究人员发现NHR-79和NHR-49的配体结合结构域在体外能够直接相互作用，形成异源二聚体，化学计量比约为1:1。当两者共存时，它们更倾向于以异源二聚体的形式与IR3元件结合，而不是单独结合。
NHR-79的P-box基序赋予其更高的结合活性和特异性
NHR-79的P-box序列为CKACAAFFRR，与常见的人类P-box有四个氨基酸差异。而NHR-49的P-box为CNGCKGFFRR，与常见序列仅一个氨基酸不同。将NHR-79的P-box替换为NHR-49的P-box后，其结合IR3的能力显著下降；反之，将NHR-49的P-box替换为NHR-79的P-box后，其结合能力增强。这表明P-box的差异是决定两者结合活性和特异性的关键因素之一。结构预测也支持了这一结论。
IR3在过氧化物酶体β-氧化和脂肪分解代谢相关基因的启动子中功能保守
生物信息学分析发现，在C. elegans基因组中，96个基因的启动子区含有与IR3类似的GACTAC重复序列，这些基因显著富集于过氧化物酶体功能、脂肪酸氧化和分解代谢等生物学过程。对其中部分基因的实验验证表明，它们确实是NHR-79和/或NHR-49的靶标。此外，在相近线虫物种C. briggsae的同源基因启动子中也发现了保守的IR3元件，并能被线虫的NHR-79识别，提示该调控机制在进化上具有一定保守性。
IR3元件响应禁食并调控脂滴中储存脂肪的消耗
功能实验表明，含有IR3元件的转基因能够响应禁食信号，驱动报告基因表达上调。在acox-3突变体中，引入含有IR3元件的acox-3转基因能够挽救其因禁食导致的脂肪消耗缺陷，而含有突变元件（IR4）的转基因则无此功能。同时，nhr-79和nhr-49突变体在禁食后脂肪消耗速率显著慢于野生型线虫。这证明NHR-79/NHR-49-IR3-过氧化物酶体β-氧化基因轴是响应营养状况、调控脂肪分解代谢的核心通路。
GACTAC构成了一套组合式二聚化编码库，用于NHR-79和NHR-49差异调控的基因
研究人员还预测并初步验证了GACTAC序列的其他排列形式（如DR0, DR6等）也可能是其他基因的调控元件。结果表明，一些含有DR0（如某些核激素受体基因）和DR6（如某些线粒体相关基因）元件的基因受NHR-49特异性调控，而不依赖于NHR-79。这表明NHR-49可能通过与其他核激素受体形成不同的异源二聚体，识别不同的GACTAC重复组合，从而实现对不同靶基因组的特异性调控。
结论与意义
本研究首次在C. elegans中发现并证实了GACTAC这一全新的核激素受体响应元件。研究结果表明，NHR-79和NHR-49通过异源二聚化特异性识别IR3形式的GACTAC，进而调控过氧化物酶体脂肪酸β-氧化通路基因的表达，在维持脂肪代谢稳态中发挥核心作用。这一发现突破了传统上认为核激素受体主要识别AGGTCA及其变体的观念，揭示了DNA识别元件的多样性。更重要的是，研究揭示了P-box基序具有惊人的可塑性，能够识别与其经典共识序列迥异的DNA重复单元。这种基于非经典元件的组合式二聚化编码机制，极大地拓展了核激素受体调控网络的复杂性和特异性，为理解包括线虫在内乃至更高等生物中核激素受体如何实现其庞大的调控功能提供了新的理论框架。该研究也为探讨代谢性疾病中核激素受体功能失调的机制提供了新的思路。
