《Nucleic Acids Research》：Pentanucleotide guanine-rich WGGGW repeats, including CANVAS AGGGA repeats, form a variety of noncanonical structures
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本研究深入探讨了与CANVAS（小脑性共济失调、神经病变、前庭反射消失综合征）相关的致病性d(AGGGA)n重复序列的复杂折叠行为。研究人员发现，在生理K+条件下，这些序列并非仅形成G-四链体（G4），而是存在G4与一种稳定的非经典平行双链体结构之间的动态平衡。这种独特的结构多态性，以及其与另一致病性d(AGGAC)n序列和非致病性d(AGAAA)n序列折叠行为的对比，为解释AGGGA重复扩展在基因组不稳定性及CANVAS发病机制中的特异性作用提供了新的结构生物学见解。
在人类基因组的复杂画卷中，短串联重复序列（STRs）如同神秘的密码，不仅贡献了遗传多样性，也与多种神经退行性疾病的发病密切相关。其中，一种名为CANVAS（小脑性共济失调、神经病变、前庭反射消失综合征）的晚发性疾病，其遗传学根源被锁定在RFC1基因内含子中的一个特殊区域——AGGGA五核苷酸重复序列的扩展。然而，一个核心的科学谜团始终悬而未决：这些看似简单的重复序列，是如何引发细胞毒性，最终导致疾病的？传统的观点倾向于归因于其形成G-四链体（G-quadruplex, G4）的能力，但真相或许远比想象的复杂。
为了揭开这一谜题，一个研究团队将目光投向了AGGGA重复序列的折叠世界。他们推测，这个纯粹的嘌呤序列可能具备结构异质性，即能够采取不止一种稳定的三维构象。这不仅包括经典的G4结构，还可能涉及通过嘌呤-嘌呤配对形成的非经典双链体。理解这些序列在不同环境下的结构偏好，是阐明其致病机制的关键一步。
研究人员设计了一系列精巧的实验。他们合成了包含4到16个不等的AGGGA重复单元，以及作为对照的其他WGGGW（W为A或T）模式序列（如TGGGT, TGGGA, AGGGT）和另一致病性序列AGGAC、非致病性序列AGAAA的寡核苷酸。研究综合运用了多种生物物理和生物化学技术，包括紫外光谱（UV）、圆二色谱（CD）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和核磁共振（NMR），系统性地分析了这些序列在生理钾离子（K+）和非生理锂离子（Li+）条件下的结构特征。
关键技术方法包括：利用等温荧光共振能量转移（Iso-FRET）竞争实验和N-甲基卟啉IX（NMM）荧光实验快速筛选G4形成倾向；通过变温UV和CD光谱获取热力学参数（如熔点温度Tm）和结构信息（如热差谱TDS）；通过非变性PAGE分析结构的分子间/分子内属性及多态性；并利用1H NMR在原子水平探测结构特征。所有实验均在模拟生理条件的缓冲液（10 mM 二甲胂酸钠，pH 7.2）中进行，并重点比较了KCl（稳定G4）和LiCl（不稳定G4）的影响。
研究结果揭示了一幅丰富多彩的结构图景：
dTGGGT重复序列：行为相对简单
d(TGGGT)n序列在KCl中稳定地折叠成分子内平行G4结构，其Tm值较高（约71-74°C）。而在LiCl中则不形成稳定结构。其行为与已充分研究的端粒类似序列d(TGGGTT)n相似。
dTGGGA和dAGGGT重复序列：展现初步多态性
这两种序列在KCl中主要形成G4结构（dTGGGA可同时形成分子间和分子内G4，dAGGGT形成分子内G4）。在LiCl中，它们能形成稳定性较低的非G4结构（推测为双链体），但这些结构的Tm远低于其在KCl中G4的Tm，因此在生理K+条件下，G4结构占主导。
致病性dAGGGA重复序列：显著的结构多态性与平衡
这是研究的核心发现。d(AGGGA)n（n=8,12,16）在生理K+条件下表现出独特的行为。它们并非单一结构，而是处于一种动态平衡之中：一部分分子形成G4结构（且主要为分子间G4），另一部分分子则形成一种非常稳定的非G4结构。综合PAGE迁移率和光谱数据分析，这种非G4结构被推断为平行的嘌呤-嘌呤双链体。尤其重要的是，这种双链体结构的稳定性（Tm≈ 55°C for n=16）与G4结构（Tm≈ 58°C for n=16）非常接近，这使得两者在溶液中能够共存。对于较短的d(AGGGA)4，其行为更为复杂，可能形成分子内、二分子或四分子等多种G4形态，但未检测到稳定的双链体。
dAGGAC和dAGAAA重复序列：对比与启示
致病性d(AGGAC)n序列在KCl和LiCl中均主要形成非G4结构（可能为反平行双链体或发夹），且稳定性较高，表明其折叠路径与AGGGA不同。非致病性d(AGAAA)n序列在缺乏Mg2+的条件下基本无结构，即使在Mg2+存在下形成的结构也不稳定（Tm较低），这与其在健康个体中的稳定状态相符。
RNA序列的研究
研究还发现，相应的RNA序列r(AGGGA)n在K+中则专一地形成非常稳定的平行G4结构（Tm> 80°C），而不像DNA那样形成双链体，显示了核酸类型对结构的显著影响。
研究的结论部分将各项发现提升到了机制解释的层面。本研究表明，CANVAS相关的致病性d(AGGGA)n重复序列的独特之处在于其在高K+环境下呈现出的显著结构多态性——G4结构与一种稳定的平行双链体结构共存。这种平衡受到重复单元数量、序列上下文（特别是W核苷酸的身份）和离子环境的精确调控。相比之下，其他dWGGGW序列或形成单一的G4，或形成的非G4结构稳定性不足以在生理条件下与G4竞争。
这一发现具有重要的意义。它表明，在考虑AGGGA重复序列的致病机制时，不能仅仅关注G4结构。这些序列所能形成的异常稳定的非经典双链体结构，同样可能在DNA复制、转录或修复过程中阻碍聚合酶的进程，或招募异常的蛋白质复合物，从而成为基因组不稳定的新的源头。这种“双刃剑”式的结构能力——既能形成G4，又能形成稳定的替代结构——可能是AGGGA motif在WGGGW家族中独树一帜，与疾病特异性关联的关键结构基础。该研究强调了在理解重复扩展 disorders 时，全面考察序列所有可能折叠构象的重要性，为后续针对CANVAS等疾病的机制研究和治疗策略开发提供了新的结构生物学框架。
