《Nature Communications》：Multistep receptor binding of the hepatitis B virus preS1 domain
编辑推荐：
本研究揭示了乙型肝炎病毒（HBV）和丁型肝炎病毒（HDV）表面蛋白preS1结构域，作为一种天然无序肽，通过其N端豆蔻酰化修饰及关键氨基酸残基（Asn9preS1、Gly12preS1、His17preS1）与宿主受体钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）的胆汁酸隧道形成串联环核心结构，实现高亲和力结合；进一步通过Trp41preS1与NTCP胞外表面相互作用稳定结合，阐明了preS1介导病毒进入肝细胞的多步成熟机制，为开发靶向病毒进入的广谱抗病毒策略提供了新见解。
乙型肝炎病毒（HBV）及其卫星病毒丁型肝炎病毒（HDV）是严重威胁全球公共卫生的病原体，它们拥有一个非常狭窄的宿主范围，主要感染人类和黑猩猩的肝细胞。这种严格的物种和组织嗜性很大程度上归因于高度特异性的病毒进入过程，其核心是病毒表面蛋白与宿主细胞受体的高亲和力相互作用。在HBV的三种表面蛋白（大、中、小表面蛋白）中，大表面蛋白（LHBs）的N端区域，即preS1结构域，对于识别宿主受体——钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）至关重要。NTCP是一种特异性表达于肝细胞的胆汁酸转运蛋白。然而，一个长期悬而未解的科学问题是：作为一种天然无序肽（IDP），结构高度灵活的preS1是如何通过构象变化实现与NTCP的高亲和力结合的？理解这一机制对于揭示HBV/HDV独特的感染过程、开发新型治疗和预防策略具有关键意义。
以往的研究虽然解析了NTCP以及preS1-NTCP复合物的冷冻电镜结构，显示N端豆蔻酰化的preS1（myr-2–48preS1）在NTCP的胆汁酸隧道中形成一种套索状结构，但其形成这种复杂构象的动态过程仍不清晰。为了解决这一问题，研究人员结合了基于结构的分子动力学模拟、病毒学实验和统计力学分析，深入探究了preS1与NTCP的结合机制。
为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。主要包括：利用荧光标记的preS1肽段（如TAMRA标记的myr-2–48preS1及其截短体或点突变体）与过表达NTCP的HepG2细胞（HepG2-NTCP）进行结合实验，通过荧光显微镜观察和量化结合信号。通过体外竞争实验和HDV病毒感染实验（使用HepG2-NTCP细胞模型和表达人NTCP的转基因小鼠模型）评估不同preS1肽段或突变体对病毒感染的抑制能力。利用解析的NTCP-preS1复合物冷冻电镜结构（如PDB ID: 8HRX, 8RQF）进行全原子分子动力学模拟，分析preS1与NTCP的相互作用细节和构象动态变化。应用WSME-L统计力学模型预测preS1肽段的折叠路径和能量景观。通过细胞表面生物素化实验和免疫印迹分析检测NTCP及其突变体在细胞表面的表达情况。使用[3H]-牛磺胆酸摄取实验评估NTCP的胆汁酸转运功能。
preS1的豆蔻酰化2-19氨基酸区域主要负责介导NTCP结合
研究人员将myr-2–48preS1划分为三个片段（myr-2–19, 20–32, 33–48）进行结合实验。结果显示，只有myr-2–19preS1能够以浓度依赖的方式与HepG2-NTCP细胞结合，尽管其结合信号在低浓度下弱于完整的myr-2–48preS1。而20–32preS1和33–48preS1片段本身则未显示出任何结合能力。更重要的是，非豆蔻酰化的2–19preS1和2–48preS1也未能结合，表明N端的豆蔻酰化修饰对于preS1与NTCP的初始结合是必需的。肽段竞争实验和HDV感染抑制实验进一步证实，myr-2–19preS1能够有效竞争抑制完整的myr-2–48preS1与NTCP的结合以及HDV的感染，但其效力（IC50= 56.2 nM）低于myr-2–48preS1（IC50= 3.8 nM），提示2-19区域是初始结合的核心，但C端区域对实现最高亲和力有贡献。
Asn9preS1、Gly12preS1和His17preS1在preS1与NTCP结合中起主要作用
在myr-2–19preS1区域中，哪些氨基酸是关键？研究人员在myr-2–48preS1背景中引入了7-19位点的单个丙氨酸突变。结合实验表明，N9A、G12A和H17A突变几乎完全废除了preS1与NTCP的结合能力。竞争实验和病毒感染实验也一致显示，携带这些突变的preS1肽段或HDV病毒颗粒，其竞争结合或感染能力显著下降（IC50值比野生型高24-39倍）。结构分析表明，N9、G12和H17这三个残基在空间上紧密靠近（距离在3.5 ?以内），在preS1的N端（7-12位，环1）和中心（13-18位，环2）之间形成了一个“核心”结构，这个核心结构被“夹”在NTCP的TM1（包含L31等残基）和TM8b（包含Q264等残基）之间，创造了大量的相互作用界面。
NTCP上的Leu31和Gln264是preS1核心结构的关键对应物，支持preS1结合
为了寻找NTCP上与preS1核心（N9, G12, H17）相互作用的氨基酸，研究人员基于结构分析筛选出L27、S28、L31、V32、L35（TM1）以及V263和Q264（TM8b）等候选残基。突变体功能实验显示，与野生型NTCP相比，L31A和Q264A突变体在细胞表面表达水平正常、胆汁酸转运功能部分保留（约为野生型的48-53%）的情况下，却显著削弱了preS1的结合能力（尤其在低肽浓度下）和HDV的感染性。这表明L31和Q264对于preS1与NTCP的高亲和力结合至关重要，其作用具有特异性，并非由于蛋白表达或整体功能缺陷所致。
分子动力学模拟揭示preS1核心在形成稳定NTCP复合物中的作用
为了从动力学角度理解N9、G12、H17的作用，研究人员进行了分子动力学模拟。对野生型及N9A、G12A、H17A、L11A、F14A突变体的模拟分析表明，野生型preS1（2-19）的构象分布相对集中，主要位于一个延伸的能谷中，其结构（特别是7-19区域）能较好地维持初始冷冻电镜结构中的构象。相反，N9A、G12A和H17A突变体则表现出更分散、更不稳定的构象分布，偏离了野生型的主要分布区域。具体而言，这些突变导致preS1内部关键原子间距离（如Cα-Cα距离：9-12, 12-17, 9-17）的分布变宽、平均值增大，表明核心结构的稳定性被破坏。进一步分析发现，N9A和H17A突变分别破坏了N9与L11主链、H17与F13/F14主链之间形成的氢键；而G12A突变则因丙氨酸侧链的甲基产生空间位阻，阻碍了H17的靠近。此外，这些突变也减少了preS1关键残基与NTCP上L31和Q264的接触频率。这些模拟结果从原子层面解释了为何N9、G12、H17的突变会损害preS1与NTCP的稳定结合。
33–48preS1与NTCP细胞膜外侧表面的相互作用增强了preS1-NTCP结合
虽然33–48preS1区域自身不能独立结合NTCP，但它能增强已经结合的preS1（通过2-19区域）与NTCP的相互作用。分子动力学模拟显示，33–48preS1（特别是其中的W41、D43、A44、N45、K46）与NTCP胞外段的多个环区（如TM2-3环、TM4-5环、TM8-9环）有接触，其中W41preS1尤为关键，它与NTCP上已知对感染重要的N87、Y146、F274等多个位点相互作用。实验证实，在myr-2–48preS1中引入组合突变（W41A/D43A/A44R或N45A/K46A）或单点突变（W41A）会显著降低其与NTCP的结合；相应地，NTCP的N87A/Y146A双突变也削弱了preS1结合和HDV感染。更重要的是，HDV病毒颗粒的preS1上携带W41A突变会完全丧失感染HepG2-NTCP细胞的能力，但不影响病毒颗粒的产生。这表明33-48区域，特别是W41，通过与其他NTCP胞外表面的相互作用，起到了稳定preS1-NTCP复合物的“脚手架”作用。
统计力学模型预测2–48preS1折叠由串联环结构起始
WSME-L统计力学模型被用来预测preS1的折叠过程。模型分析表明，preS1（2-48）的折叠是一个渐进过程，其自由能随着折叠程度增加而升高，这与preS1作为IDP的特性一致。更重要的是，模型预测在preS1自发折叠时，其N端的2-19区域（特别是7-19位点，即形成环1和环2的区域）会率先形成结构，而C端的39-48区域折叠最慢。二维自由能景观分析进一步支持了“2-19区域先发生显著折叠，随后20-48区域再跟进折叠”的路径是能量上最有利的。这从理论计算上支持了实验观察到的“preS1与NTCP结合可能遵循先由2-19区域核心结合，再由33-48区域稳定”的多步机制。
N9preS1、G12preS1和H17preS1对于病毒在细胞和小鼠模型中产生感染性至关重要
功能实验最终验证了上述关键残基的生物学意义。研究人员构建了在LHBs的preS1区域携带N9A、G12A或H17A突变的HDV病毒颗粒。这些突变并不影响病毒颗粒的组装和释放（病毒RNA产量正常）。然而，无论是在HepG2-NTCP细胞培养模型还是人源化NTCP转基因小鼠模型中，这些突变病毒都完全丧失了感染能力。这强有力地证明了preS1中由N9、G12、H17形成的核心结构对于病毒获得感染性是不可或缺的。
综上所述，本研究通过多学科技术手段，揭示了HBV/HDV的preS1结构域以一种多步骤的“结合成熟”机制高效识别其受体NTCP。该过程始于N端豆蔻酰化引导的病毒颗粒与细胞膜的接近，继而preS1的2-19区域（关键残基N9、G12、H17）折叠形成核心结构，精准嵌入NTCP的胆汁酸隧道，实现初始的高亲和力结合（核心形成步骤）。随后，preS1的33-48区域（关键残基W41等）与NTCP的胞外表面发生相互作用，进一步稳定了整个复合物（外表面相互作用步骤）。这种由天然无序肽介导的、分步进行的受体识别机制，不仅确保了病毒的高效感染和严格的宿主特异性，也为开发能够干预病毒进入不同步骤的新型抗病毒药物（如靶向核心结合或稳定相互作用的抑制剂）提供了精细的分子蓝图和潜在的靶点。这项研究成果已发表在《Nature Communications》期刊上。
