《Transboundary and Emerging Diseases》：Towards Integrated Surveillance of Marine Brucellosis: Diagnostic and Phylogenetic Assessment of Brucella ceti in Stranded Dolphins of the Western Mediterranean Sea
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本文综述了西地中海海域（西班牙瓦伦西亚社区海岸）2011-2021年间搁浅的30头鲸豚（涉及条纹海豚、里氏海豚和普通宽吻海豚）中鲸型布鲁氏菌（Brucella ceti）感染的诊断与分子特征。研究通过细菌分离培养、实时荧光定量PCR（qPCR）、血清学检测（RBT和bELISA）及全基因组测序（WGS）进行综合诊断，确认了B. ceti的高感染率（培养阳性率46.7%，qPCR阳性率50%），并揭示了其与脑膜脑炎等中枢神经系统（CNS）病变的强关联。研究首次系统评估了商用阻断ELISA（bELISA）在海豚血清中的应用条件，强调了诊断方法标准化的重要性。系统发育分析鉴定出ST26和ST49两种序列型（ST），表明该区域B. ceti存在遗传多样性。该研究为海洋哺乳动物布鲁氏菌病的监测、诊断及“一体健康”（One Health）视角下的风险评估提供了重要科学依据。
引言
布鲁氏菌（Brucellaspp.）是一类革兰氏阴性胞内寄生菌，多数为人畜共患病原体。自1994年首次从海洋哺乳动物（海豹、鼠海豚和海豚）中分离到布鲁氏菌以来，该病原体已在多种海洋哺乳动物中被检测到。2007年，根据其主要宿主关联性，分别将在鲸豚类和鳍足类动物中发现的菌株命名为鲸型布鲁氏菌（B. ceti）和鳍足类布鲁氏菌（B. pinnipedialis）。随后的分子分析进一步将这些菌株划分为五个不同的序列型（ST）：ST23、ST24、ST25、ST26和ST27。其中，B. ceti与ST23、ST26和ST27相关，而B. pinnipedialis则与ST24和ST25相关。鲸豚感染布鲁氏菌最常报告的病变是脑膜炎或脑膜脑炎，但该感染也与一系列其他病理状况相关，包括生殖系统病理、骨骼异常、呼吸道病变、肝脾淋巴结肿大以及皮下脓肿等。
材料与方法
本研究调查了2011年至2021年间在西班牙瓦伦西亚社区海岸搁浅的30头疑似布鲁氏菌感染的鲸豚，包括25头条纹海豚（Stenella coeruleoalba）、3头里氏海豚（Grampus griseus）和2头普通宽吻海豚（Tursiops truncatus）。对个体进行了详细的尸检和组织采样。诊断方法包括细菌学检查（在选择性培养基上进行细菌培养并通过Bruce-ladder和海洋动物特异性多重PCR进行鉴定）、分子诊断（通过qPCR检测Brucellaspp.的IS711插入序列）、血清学分析（使用玫瑰 Bengal试验（RBT）和商业阻断ELISA（bELISA））以及组织病理学分析（对中枢神经系统等多个组织进行H&E染色镜检）。此外，对培养阳性的B. ceti分离株进行了全基因组测序（WGS）和系统发育分析。
结果
3.1. 诊断结果
通过细菌培养和随后的PCR确认，46.7%（14/30）的受检海豚存在B. ceti感染。在155份培养样本中，有25份（16.1%）分离到了细菌。使用循环阈值（Ct）40作为临界值，qPCR在50.0%（15/30）的动物中检测到Brucellaspp. DNA。以细菌学为金标准，按个体计算的qPCR阳性预测值（PPV）为73.3%，阴性预测值（NPV）为80.0%。从器官或样本的阳性比例来看，细菌更常从中枢神经系统（CNS）（14/39, 35.9%）分离到，其次是脾脏（6/23, 26.1%）、气管支气管淋巴结（2/23, 14.8%）和咽扁桃体（1/14, 7.14%）。qPCR检测阳性率从高到低依次为CNS（23/83, 27.7%）、生殖组织（3/19, 15.8%）、咽扁桃体（3/23, 13.0%）、纵隔淋巴结（2/23, 8.70%）、脾脏（2/26, 7.69%）、肝脏（2/29, 6.90%）和肺脏（1/27, 3.70%）。组织病理学分析显示，12只布鲁氏菌感染阳性动物表现出中度至重度的脑膜脑炎或脑膜脑脊髓炎，伴有淋巴细胞、浆细胞浸润，以及不同程度的组织细胞和少量中性粒细胞。病变最常累及大脑、脑干和脊髓。血清学分析表明，需要优化商用bELISA的血清稀释度（初步建议1:20）和截断值以提高其用于海豚诊断的特异性，而RBT则可能出现假阴性。
3.2. 遗传学研究
对14头不同动物的分离株进行的WGS和系统发育分析显示，所有分离株均属于B. ceti的ST26（n=10）和ST49（n=7）序列型。这两个ST之间存在57-148个高质量单核苷酸多态性（hqSNP）的差异。分离株与同期在西班牙、意大利和葡萄牙检测到的菌株位于同一进化枝，提示可能存在地理聚集性。对同一动物不同组织来源的分离株进行比较发现，大部分菌株在个体内高度保守（hqSNP差异为0），但有一例个体内不同组织分离株存在5个hqSNP差异。不同个体分离株之间的hqSNP差异范围较大（2-144个），为未来界定流行病学相关菌株的SNP阈值提供了参考数据。
讨论
本研究证实了B. ceti，特别是其对条纹海豚的易感性以及其神经嗜性。诊断方面，研究强调了在海洋哺乳中验证血清学检测（尤其是商用bELISA）的重要性，并表明在优化方案下，细菌培养对于确诊具有高效性，而组织病理学和qPCR为监测提供了有力支持。遗传学分析揭示了西地中海海域流行的B. ceti主要为ST26和新近报道的ST49，未发现已知人畜共患的ST27型，但鉴于人与海豚互动增加，仍需持续监测。研究还观察到与其他病原体（如鲸豚莫比立病毒（CeMV）、伽玛疱疹病毒（GHV））的混合感染，提示在诊断和病理分析时需考虑其相互作用。对同一动物不同组织及不同时间点菌株的基因组比较，为了解B. ceti在宿主体内的进化及传播动力学提供了新见解。
结论
本研究加深了对西地中海鲸豚布鲁氏菌病的诊断、病理学和分子流行病学的理解。结果表明需要采用综合诊断方法并进行适当验证，特别是血清学检测。遗传学数据揭示了该地区B. ceti的多样性，主要为ST26和ST49。该研究为海洋哺乳动物布鲁氏菌病的监测和控制以及从“一体健康”角度评估其风险提供了重要信息。
