环状RNA Vv-circCOR27通过调控VvHSP90.2b-VvHsfA7a互作精细调节葡萄耐热性的分子机制

《New Phytologist》：Circular RNAVv-circCOR27 modulates thermotolerance through attenuating VvHSP90.2b-VvHsfA7a interaction in grapevine

本综述系统解析了葡萄中环状RNA Vv-circCOR27在热胁迫应答中的新型调控机制。研究发现，Vv-circCOR27通过直接结合分子伴侣VvHSP90.2b，竞争性抑制其与热激转录因子VvHsfA7a的相互作用，从而负向调控下游小热激蛋白（sHSP）基因的表达，最终降低植物的耐热性。该工作首次揭示了植物circRNA通过“分子海绵”机制调控HSP90-Hsf信号通路，为理解非编码RNA在植物高温应答中的功能提供了新视角。

　　

环状RNA Vv-circCOR27的鉴定与表达分析

研究团队在葡萄中鉴定出一个长度为502核苷酸的环状RNA分子，命名为Vv-circCOR27。该分子由VvCOR27基因的第二和第三外显子通过反向剪接形成，其环化连接点（AG/GA）经过全长克隆和Sanger测序验证。表达分析显示，Vv-circCOR27在热胁迫（45°C）下表达受到抑制，且在耐热性强的葡萄品种中表达水平显著低于热敏感品种。亚细胞定位实验表明该circRNA同时定位于细胞质和细胞核。

Vv-circCOR27过表达加剧热敏感性

为探究其功能，研究团队开发了“内含子保留”策略，通过在外显子中插入额外内含子，成功构建了以产生circRNA为主的过表达载体，有效降低了同源线性RNA的背景表达。在葡萄胚性愈伤组织和幼苗中的过表达实验表明，Vv-circCOR27的过量表达会显著加剧热胁迫导致的组织褐化损伤，表现为叶绿素荧光参数（F_v/F_m）下降以及丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量升高，证明其负向调控葡萄的耐热性。

Vv-circCOR27直接结合VvHSP90.2b并干扰其与VvHsfA7a的相互作用

通过体内交联circRNA pull-down结合质谱分析，发现Vv-circCOR27能与热休克蛋白90.2b（VvHSP90.2b）直接结合。进一步的RNA免疫共沉淀（RIP）和环状RNA三分子荧光互补（cTriFC）实验证实了二者在体内的直接互作。机制研究表明，VvHSP90.2b能与热激转录因子VvHsfA7a发生相互作用。而Vv-circCOR27的过表达会竞争性结合VvHSP90.2b，从而削弱VvHSP90.2b与VvHsfA7a的结合。

VvHsfA7a调控下游小热激蛋白基因的表达

DNA亲和纯化测序（DAP-seq）分析揭示了VvHsfA7a的结合基序（CNNGAANNTTC），并发现其可结合到多个小热激蛋白（sHSP）基因的启动子区。酵母单杂交（Y1H）实验验证了VvHsfA7a与sHSP基因启动子的特异性结合。在热胁迫下，VvHsfA7a表达被强烈诱导（上调300-400倍），并激活包括HSP15.7、HSP17.3、HSP18.2c等在内的9个sHSP基因的表达。在Vv-circCOR27过表达的愈伤组织中，这些sHSP基因的诱导表达水平显著低于野生型。

工作模型

本研究提出了一个Vv-circCOR27调控葡萄耐热性的工作模型：在正常条件下，Vv-circCOR27表达水平较高，它通过结合VvHSP90.2b，可能阻碍了VvHSP90.2b对VvHsfA7a的分子伴侣功能。在热胁迫下，Vv-circCOR27表达下调，解除了对VvHSP90.2b的抑制，使得VvHSP90.2b能够充分协助VvHsfA7a的转录激活功能，进而促进下游sHSP基因的表达，帮助细胞抵御热损伤。该研究阐明了circRNA作为一种新型调控因子，通过HSP90-HsfA7a-sHSP通路精细调控植物热胁迫应答的分子机制。