《Small》：Thermo-Chemically Modified Silk Scaffolds Reveal Niche-Driven Regulation of Hematopoiesis and Fibrosis
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本文综述了基于热化学处理丝素蛋白构建的可调控三维骨髓模型，该模型能精确模拟骨髓微环境的机械与结构特征，支持间充质干细胞（MSC）与造血干细胞/祖细胞（HSPC）的功能性相互作用，并成功再现了生理性及纤维化（TGF-β1诱导）状态下的巨核细胞分化与血小板生成。研究通过引入发散指数（Divergence Index）量化微环境驱动的功能障碍，为解析造血异常及评估患者来源系统的治疗策略提供了量化平台。
1 引言
体外重建人体骨髓微环境是深化造血理解及疾病研究的关键挑战。本研究提出一种基于丝素蛋白（silk fibroin）的完全可调骨髓模型，该材料通过热化学加工工程化，以复刻天然骨髓的机械与结构特征。此三维平台整合了间充质基质细胞（MSC），并支持造血干细胞和祖细胞（HSPC）功能性分化为成熟巨核细胞和血小板。在生理调谐支架上培养的MSC的RNA测序显示，其转录程序与天然基质高度一致，验证了工程化生态位的保真度。该模型捕获了包括基质重塑和灌注流在内的关键骨髓动力学，可直接评估血小板生成功能。为模拟纤维化重塑，支架用TGF-β1功能化，诱导MSC向肌成纤维细胞样细胞转变，重现了骨髓增殖性肿瘤（MPN）的病理特征。在此背景下，患者来源的HSPC表现出巨核细胞成熟受损和钙信号异常，通过干扰钙流可部分恢复。为量化微环境驱动的功能障碍，研究采用发散指数（Divergence Index）计算巨核细胞大小分布的变化。该功能指标与工程化生态位相结合，为剖析失调的造血功能及评估患者来源系统的治疗策略提供了强大且可量化的平台。
2 结果
2.1 利用Micro-CT和先进成像解码骨髓生态位结构
采用微计算机断层扫描（Micro-CT）分析小鼠股骨和胫骨的复杂结构，详细描绘了长骨骨小梁的海绵状结构。高分辨率三维重建清晰显示了造血微环境的关键特征——多孔组织。对小梁体积、厚度和孔径的定量分析显示，股骨和胫骨参数具可比性。免疫荧光染色提供了骨和骨髓中两个关键细胞外基质（ECM）成分——纤连蛋白（Fibronectin）和I型胶原（Type I collagen）的空间定位，已知二者调控血小板生成。纤连蛋白广泛分布于骨骼和骨髓中，强调其在维持整个造血生态位结构完整性中的作用。I型胶原在骨髓中表达较弱，主要定位于密质骨，表明其在骨结构组织中占主导地位。定量分析证实了这些差异，纤连蛋白在骨髓中的面积覆盖率显著高于I型胶原。在此背景下，MSC和内皮细胞的主要抗原标志物Endoglin见于血管周围区域及整个骨髓的血管内空间，表明基质对接近成熟并迁移入循环的成熟血祖细胞具有活跃支持作用。巨核细胞标志物Cd41+细胞被发现聚集在Endoglin附近，并嵌入富含纤连蛋白的网络中。血管是前血小板形成的动态部位，其延伸指向血管腔，剪切力促进血小板释放入血流。研究发现巨核细胞在向形成前血小板细胞生理转变过程中，其体积和表面积覆盖度表现出显著异质性，其特征是表面积体积比增加和细胞球形度降低，反映了与前血小板延伸相关的动态形态变化。较小的巨核细胞表面积覆盖较少，表明处于较早的成熟阶段。Micro-CT与高分辨率成像的结合，使我们能够确定构建最佳支持性血栓形成微环境所需的关键组件。
2.2 工程化丝素蛋白结构以模拟骨髓微环境
天然丝素蛋白以二聚体形式存在，由一条重链（~390 kDa）和一条轻链（~25 kDa）通过单个二硫键连接而成。丝素从家蚕茧中通过脱胶提取，随后溶解于溴化锂并进行透析。根据脱胶时间的不同，丝素蛋白的分子量分布可被调节。本文探讨了脱胶时间依赖性变化对丝素的影响，以优化材料特性及随之产生的与骨髓建模相关的细胞行为。脱胶10、30或50分钟的样品分别命名为SF10、SF30和SF50。脱胶过程中，质量损失分数随脱胶时间增加而增加（10分钟后为25.2 ± 0.2% wt.，30分钟后为26.0 ± 0.2% wt.，50分钟后为28.4 ± 0.4% wt.）。10分钟后丝胶蛋白被完全去除。质量损失可能源于碱性条件下蛋白质骨架的水解裂解导致的降解。不对称流场流分离（AF4）与MALS/RI检测显示，SF30的整个分子量分布相对于SF10向显著更低的值移动，这与先前类似条件下丝素降解的报告一致。进展到SF50相对于SF30在分子量上引起了进一步变化，尽管差异无统计学显著性。尺寸上，SF10和SF30相似，具有相当的Rg值，尽管分子量不同；而SF50的Rg增加。这些发现表明了一个两步过程：初始阶段的显著丝素降解，随后是由分子解折叠驱动的结构变化。其他实验结果证实了这一解释。丝素形状，通过其Rg/Rh比率、通过动态光散射测量的流体力学半径表示，SF10和SF30的形状因子分别为0.65-0.8，SF50则高达1.3，表明前两者结构紧凑，而后者发生了显著解折叠。此外，FTIR光谱中酰胺II带具有与β-折叠和α-螺旋相关的组分。SF10和SF30的两种组分比率相似，但SF50较低，表明更长的脱胶时间降低了肽域含量，这些肽域负责丝素正确折叠成β-折叠。相应地，硫黄素T的β-折叠相关荧光强度从SF10到SF50降低，表明随着脱胶时间延长，β-折叠含量显著减少。最后，通过扩散波谱研究的片段弛豫模式的发展显示，SF50中出现新的弛豫模式，表明更高的分子流动性。SF10以及在较低程度上SF30表现出更具弹性（和刚性）的行为，具有较低的tan(δ)值和较高的G′。通过定义耗散因子为指定区域外与区域内G′的比率，揭示SF50与SF10和SF30相比表现出更低的弹性。总体而言，数据表明SF10和SF30因脱胶过程中显著降解而分子量不同，但保留了相似的β-折叠相关内部有序性。SF50与SF30相比未经历显著增加的降解，但在β-折叠含量方面与SF10和SF30均不同。
2.3 具有骨髓微环境结构及机械保真度的3D丝素支架
通过将蛋白质溶液与作为致孔剂的NaCl颗粒（过筛至约500 μm直径）混合，采用盐浸法制备丝素蛋白支架。干燥后，支架在水中水化以溶解盐。由此3D支架分别命名为S_SF10、S_SF30和S_SF50。扫描电子显微镜和原子力显微镜显示三种支架具有相当的表面粗糙度，分布范围为0.2–0.7 μm。相反，通过纳米压痕获得的杨氏模量随脱胶时间增加而降低，顺序为S_SF10 > S_SF30 >> S_SF50。在旋转流变学中，所有样品均显示弹性行为。在线性粘弹性区域内，储能模量在频率扫描和应变扫描中均持续比损耗模量高约一个数量级；在前者中，G′和G′′均显示平坦依赖性，证实了弹性性质。S_SF50在低于1–2 Hz时例外，其模量随频率降低而降低，这不能归因于弛豫现象的发生，因为在tan(δ)中未观察到相应的峰值。振幅扫描显示所有样品的LVR延伸相似。总体而言，这些分析表明，从体相（平均G′）和表面（杨氏模量）测量获得的支架刚度值具有可比性。只有S_SF30显示出统计学差异，两个参数似乎能很好地按比例缩放。同时，观察到水膨胀程度存在显著差异：S_SF10显著低于S_SF30和S_SF50。正如预期，膨胀与刚度负相关，如其与G′的关系所示。模量与SF的分子描述符（包括其分子量及其形成β-折叠的能力）相关性良好。支架间的分子间β-折叠与丝素蛋白分子量的相关性优于分子内β-折叠。总体力学特性（tan(δ)）和抗不可逆变形能力对分子描述符不敏感，表明这些特征取决于恒定的成孔条件。丝素蛋白在脱胶过程中的变性影响后续3D支架生产过程中的分子间β-折叠形成，导致具有不同机械性能的结构。基于S_SF10和S_SF50差异最显著的证据，选择这两种支架进行下游生物学测试。
2.4 丝素支架顺应性调节MSC功能及血栓形成
越来越多的证据表明基质刚度和弹性在调节干细胞行为中的重要性，影响粘附、细胞骨架组织和分化等关键过程。为开发功能性3D骨髓模型，必须考虑人间充质基质细胞与支架材料的生化和机械特性之间的动态相互作用，这直接影响MSC的体外功能。具体而言，表面微观几何形状和机械顺应性等特征已知会显著影响MSC生物活性。本研究旨在生成一个类似于人骨髓特征以支持血栓形成的微环境，首先评估了各种3D支架在基础扩增培养基中维持MSC干性的能力，并使用标准培养作为对照进行比较。MSC完全填充支架，保持干性标志物表达，证明在3D微环境中自我更新潜能得以保留。MSC具有多能性，能够分化为多种细胞类型。当向特定谱系定向时，MSC经历显著的形态和功能改变。通过将MSC在成骨或成脂培养基中分化，在标准液体培养和3D支架中评估了MSC的适应性。在成骨条件下，MSC分化为骨桥蛋白阳性（OSTEOPONTIN+）的成骨细胞，RUNX2、SPP1和ALPL表达显著增加。当MSC定向于脂肪细胞谱系时，它们经历一系列协调事件，导致成熟脂肪细胞发育。脂滴相关关键蛋白Perilipin在脂肪细胞功能和脂质代谢中起关键作用。在不同丝素支架内的成脂条件下培养的MSC分化为PERILIPIN+脂肪细胞，显示出与标准培养中观察到的相似的脂滴积累。S_SF10和S_SF50支架之间未观察到差异，表明保持了相当的分化潜能。RNA测序提供了标准2D培养或不同3D丝素骨髓模型中MSC转录组的定量快照。与形态学分析和已验证的分化潜能一致，RNA-seq显示在所有测试条件下干性相关基因表达无显著差异。采用差异基因表达分析识别S_SF10和S_SF50与标准培养相比表达有显著变化的基因。此分析结果通过火山图直观呈现。转录组变化的全面概述在S_SF50（最软的支架）中识别出显著更多的差异表达基因。为深入了解这些DEG影响的生物学功能和过程，进行了基因本体分析，基于相关生物过程、分子功能和细胞组分对基因进行分类。几个富集的GO术语对胶原和蛋白聚糖沉积至关重要。特别是在培养皿标准培养中，与S_SF50相比（但与S_SF10支架相比则否），与ECM重塑相关的基因上调。MSC分泌ECM组分在塑造其周围微环境中起关键作用。由培养基底机械特性驱动的基因表达谱变化表明，在最硬的基底上，MSC可能自发沉积富含胶原组分的ECM，导致形成无法复制天然骨髓生态位的异常微环境。S_SF10和S_SF50支架的3D重建表明，MSC通过分泌I型胶原和纤连蛋白积极贡献于塑造其生态位样微环境。尽管S_SF10支架促进了I型胶原的显著增加沉积，导致胶原与纤连蛋白比率发生变化。MSC植入对两种支架的刚度贡献极小，其数量级与裸支架测量值相当。I型胶原和纤连蛋白水平的适当调节对于创造支持血小板生成的微环境至关重要。不利的胶原与纤连蛋白比率可能阻碍这些过程，导致次优的细胞反应。因此，研究了不同的3D丝素支架是否有助于或不有助于巨核细胞生成。为解决此问题，开发了一个两阶段工作流程。最初，在各种丝素支架内生成MSC-ECM微环境。随后添加人成人HSPC，并同时诱导其在TPO存在下向巨核细胞分化。将所得生态位嵌入模块化流动腔中，在灌注流动培养基中诱导血小板出芽，模拟血流。S_SF10和S_SF50支架的渗透性通过Micro-CT成像和达西系数计算进行评估，显示两种支架之间 distinct 的结构和功能差异。Micro-CT重建突出了S_SF10相较于S_SF50更开放多孔结构的更致密结构。孔径厚度和孔隙率分布的定量分析进一步证实了这些差异，S_SF50显示出更大且更互连的孔，与天然骨结构分析中观察到的相当。达西系数显示S_SF50支架的流体渗透性显著更大，这一特性支持增强的营养交换并促进血栓形成生态位内的细胞功能。支架内细胞的免疫表型分析提供了细胞行为的详细见解。CD34+HSPC均匀分布在整个3D支架体积中，并与CD90+MSC形成紧密关联。两周内，HSPC分化为表达谱系特异性标志物如CD61和CD42b的多倍体巨核细胞，模拟了天然骨髓中观察到的表型特征。S_SF50支架显示出更高密度的血栓形成生态位，并且与S_SF10相比巨核细胞体积显著增加，同时球形度降低，表明 advanced 成熟和增强向产血小板细胞的分化。如所述，细胞体积和面积覆盖的定量分析为巨核细胞成熟阶段及其在血栓形成中的功能作用提供了关键见解。S_SF50支架表现出增强的前血小板形成，其特征是细胞体积增加、表面积覆盖更大和球形度降低，反映了与S_SF10相比前血小板轴广泛分支。灌注实验显示，在S_SF50支架中培养的巨核细胞血小板产量显著更高，突出了其支持生理性血栓形成和高效血小板释放的卓越能力。这些发现强调，具有开放多孔结构和优化胶原与纤连蛋白比率的S_SF50支架创建了一个柔软、仿生的生态位，支持巨核细胞生成并促进高效血小板生产。
2.5 使用丝素系统模拟骨髓纤维化
为探索骨髓增殖性肿瘤（MPN）的病理动力学（一种以进行性骨髓纤维化为特征的克隆性干细胞疾病），采用基于丝素的骨髓模型主动复制并研究与人类疾病相关的生化和细胞紊乱。使用患者来源的样本建立原发性骨髓纤维化早期和晚期阶段的平行对比。患者骨髓活检的组织学和免疫组织化学分析显示ECM组成发生显著变化，晚期纤维化阶段以网状纤维、I型胶原、纤连蛋白以及α-SMA阳性肌成纤维细胞积累增加为特征。定量分析证实了这些发现，显示晚期纤维化中网状纤维、I型胶原、纤连蛋白（包括通常在纤维化期间表达的额外结构域A纤连蛋白异构体）和α-SMA阳性细胞水平升高。转化生长因子-β1在MPN进展中的骨髓纤维化发病机制中起核心作用。它主要由恶性巨核细胞分泌，驱动骨髓微环境的病理重塑。为重现并探索这些病理特征，利用将TGF-β1掺入S_SF50支架（称为S_SF50+TGF支架）的方法。传统上，TGF-β1以其活性形式添加到生长培养基中用于纤维化激活的体外研究。然而，这种方法不能完全代表调节生长因子释放的天然细胞-ECM相互作用。S_SF50+TGF支架在指纹光谱区的拉曼光谱显示了β-折叠域的特征峰。仅在S_SF50+TGF支架中检测到二硫键振动模式，而在S_SF50支架中未检测到。SF50中β-折叠域的存在较低可能增强蛋白质胺键的溶剂可及性，潜在地改善载药过程中负载药物的分布均匀性。培养基中TGF-β1浓度的量化显示每日释放，类似于在明显纤维化阶段患者队列骨髓抽吸物中量化的量。从丝素支架控制释放TGF-β1旨在提供动态微环境，在HSPC共培养前支持MSC并引导其通过纤维化发展。实际上，整合到S_SF50+TGF支架中的人MSC表现出增加的胶原沉积，如与S_SF50支架相比的网状纤维和Masson三色染色所示。此外，纤维化支架中ECM组分沉积显著增加，包括I型胶原、纤连蛋白、EDA-纤连蛋白，并且α-SMA+细胞数量显著增加。为定义模型对TGF-β掺入的响应，对在S_SF50+TGF支架中培养的MSC与在S_SF50中培养的MSC进行了RNA-seq分析。DEG和随后的GO分析揭示了ECM组分合成基因的上调。这些变化对应于支架的硬化。尽管存在这些差异，两种生态位支持相当的HSPC植入，表明系统在细胞接种和共培养能力方面的总体效率在条件间是等效的。
2.6 发散指数揭示纤维化如何塑造巨核细胞动力学
为探究微环境在骨髓纤维化进展中的作用，将源自MPN患者的JAK2V617F突变巨核细胞在对照丝素支架或与TGF-β1混合的纤维化支架中离体培养。患者骨髓活检与基于丝素的模型之间的组织学比较显示，丝素支架忠实地再现了患者骨髓的关键病理特征，包括纤维化生态位内巨核细胞尺寸减小。在丝素支架内，频率分布分析显示，与健康对照相比，MPN来源样本中巨核细胞向更小尺寸转变，尤其在纤维化条件下，紧密镜像了患者活检中观察到的尺寸分布。为定量捕获生态位组成对巨核细胞尺寸分布的离体影响，引入了发散指数，计算为条件间类别频率绝对差之和，归一化到理论最大值。DI阈值为0.4定义了中度和显著发散之间的边界。DI值表明在对照生态位中培养的MPN样本存在中度发散，而在纤维化条件下显著增加，突出了生态位重塑对巨核细胞成熟的渐进影响。储存操作钙进入是巨核细胞与骨髓ECM环境相互作用的关键调节因子，其失调是MPN的标志。为验证模型对钙靶向治疗的响应性，评估了SOCE抑制对在纤维化支架内培养的MPN来源巨核细胞的影响。MPN巨核细胞表现出明显的钙尖峰和振荡，使用选择性SOCE抑制剂BTP-2可显著抑制。这种药理学调节导致巨核细胞成熟部分恢复，证据是细胞面积显著增加。这种效应通过DI从0.61降至0.29定量捕获，对应于与健康分布曲线的偏差减少了50%。通过将仿生支架设计与定量读数相结合，开发了一个多功能平台，该平台不仅能复制患者特异性组织病理学，还能捕获微环境变化如何影响巨核细胞行为。发散指数的加入为评估疾病进展和治疗反应提供了功能指标。
3 结论
开发了一种使用基于丝素蛋白的支架的先进骨髓组织模型，该模型能复制天然骨髓的弹性特性和结构。通过微调蚕茧脱胶和控制丝素蛋白β-折叠形成，工程化了一种生物材料，该材料在支持MSC功能的同时，保留了天然生态位的生物力学特征。在软丝素支架上培养的MSC有效粘附并在两周内保持未分化状态，维持其生理特性。仅在这些支架中，MSC显示出指示健康骨髓微环境的基因表达谱，具有良好调节的ECM组成。当HSPC接种到软丝素-MSC支架上时，它们在TPO存在下成功分化为功能性巨核细胞。相反，在较硬的丝素-MSC共培养条件下，分化受损。这些发现突出了支架顺应性在维持MSC功能和促进造血中的关键作用，将软丝素支架定位为生理骨髓建模的理想平台。为模拟骨髓纤维化中的骨髓重塑，将TGF-β1掺入最软的丝素支架，驱动MSC向肌成纤维细胞分化，并促进纤维化基质组特征性的ECM沉积。这种生物工程骨髓生态位捕获了患者样本中观察到的纤维化的结构和分子特征，为在类人环境中研究造血功能障碍提供了相关环境。尽管携带相同的病理突变，患者来源的HSPC根据微环境响应不同，纤维化生态位诱导过度增殖、成熟受损和血小板产生缺陷。这些发现表明微环境不是被动背景，而是疾病表型的主动决定因素。通过解耦遗传和外在驱动因素，方法揭示了在常规模型中无法观察到的造血失调机制。为定量评估给定造血表型偏离生理条件的程度，开发了发散指数，一个多参数系统，整合了工程化生态位间的细胞、分子和机械读数。该指数能够比较评估不同骨髓微环境，并提供定量评分系统以分层疾病严重程度和进展。通过将此指数嵌入模型，创建了一个可扩展的框架，用于机制研究和临床前测试，包括患者特异性疾病建模和药物筛选。该平台围绕HSPC和MSC构建，能够模块化重建骨髓复杂性，为解码在健康和疾病中塑造造血的环境线索提供了新机会。
