利用木质素抑制生物酸矿井排水（AMD）：结构-活性关系及抑制酸铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）的分子失活机制

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Biotic Acid Mine Drainage (AMD) Suppression Using Lignin: Structure-activity Relationship and Molecular Inactivation Mechanism of Inhibiting Acidithiobacillus ferrooxidans

木质素通过诱导活性氧物种破坏酸杆菌膜合成、代谢及信号传导，抑制酸性矿井水形成。研究揭示低分子量木质素活性更强，为AMD治理提供新策略。

　　

Binyuan Gao|Zhuoran Dong|Lizhen Jia|Dumengfei Chen|Haina Cheng|Hongbo Zhou|Yuguang Wang|Zhu Chen

中南大学矿物加工与生物工程学院，中国湖南省长沙市

摘要

酸性矿井排水（AMD）是一个臭名昭著的环境问题，其经济和环境可持续管理仍然具有挑战性。AMD形成的主要驱动力是黄铁矿的生物氧化作用，这一过程主要由嗜酸细菌如Leptospirillum和Acidithiobacillus介导。我们之前的研究表明，木质素可以有效抑制Acidithiobacillus ferrooxidans对黄铁矿的氧化作用，从而从源头上防止AMD的形成。在此基础上，本研究探讨了木质素在抑制A. ferrooxidans活性方面的结构-活性关系。研究发现，低分子量的木质素具有更强的抗菌活性，主要是通过诱导细胞内外的活性氧（ROS）实现的。此外，转录组分析表明，木质素影响了细菌的关键生理途径，包括膜生物合成、碳水化合物代谢和信号转导。这种影响导致细菌内部碳源的过度消耗，并破坏其内部信号转导系统，最终抑制生物膜的形成。这种破坏最终导致细胞损伤和细菌死亡。总体而言，本研究为选择和制备高抗菌活性的木质素以增强AMD控制提供了技术指导，同时也揭示了木质素抑制A. ferrooxidans的分子机制，为预防酸化和支持新矿区的生态恢复提供了科学依据。

引言

采矿业在全球技术和经济发展中发挥了重要作用，并为世界提供了持续的能源供应。虽然它带来了巨大的经济效益，但也导致了矿区的生态失衡。采矿作业产生的尾矿已成为影响矿区环境的主要污染源[1]。尾矿中的硫化物矿物在接触空气和水后会发生复杂的生物和化学反应，形成酸性矿井排水（AMD）[2; 3]。属于Leptospirillum和Acidithiobacillus属的嗜酸细菌，尤其是Acidithiobacillus ferrooxidans，可以通过促进硫化物矿物的分解和氧化显著加速这一过程[4; 5]。据报道，当A. ferrooxidans参与氧化时，金属硫化物矿物的氧化速率会增加几个数量级[6]。这种快速氧化会增加高酸性AMD（pH<4）的生成量，释放出包括硫酸盐和重金属离子（Fe、Cu、Zn、As等）在内的有害物质，从而加剧环境污染[7]。当这种有毒废水进入地下水、河流和湖泊时，会引发一系列环境问题，对水生生物的生存能力和人类健康构成持续威胁[8; 9]。此外，AMD的污染效应是持久的；即使在矿山关闭几十年后，消除这种污染仍然具有挑战性和高昂的成本[10]。因此，开发从源头上减少AMD形成的处理策略对于减轻其造成的危害至关重要。

使用杀菌剂来抑制或杀死微生物，特别是A. ferrooxidans，可以有效抑制AMD的产生[11]。大多数传统杀菌剂，如食品防腐剂、洗涤剂和阴离子表面活性剂（例如SDS和十二烷基苯磺酸钠）[11]，存在显著局限性，包括固有的毒性、潜在的环境负面影响、促进环境微生物的抗菌素耐药性以及需要反复使用，这些都会增加使用成本。木质素是一种天然的多酚聚合物，具有多种生物活性，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌（如Staphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa、Salmonella enteritidis和Bacillus cereus）具有优异的抗菌活性[12], [13], [14], [15]。随着全球对“碳中和”的追求，木材纤维生物精炼产业得到了快速发展，木质素副产品的年产量持续增加。预计到2030年，全球木质素产量将达到2.25亿吨[16]。因此，考虑到木质素出色的抗菌特性和广泛的可用性，以及传统杀菌剂在AMD源头控制方面的局限性，将其作为抗菌剂用于AMD的预防和控制是一种协同解决方案。这种策略利用工业副产品进行环境修复，体现了“用废物治理废物”的可持续发展理念。这种范式不仅有助于直接控制AMD的源头，还促进了木质素的有益资源利用。

虽然我们之前的研究已经证明了木质素抑制黄铁矿生物氧化和防止AMD形成的潜力[17]，但木质素的内在结构异质性仍然是其优化的主要障碍。众所周知，木质素的抗菌效果严格受其结构-活性关系的控制。

例如，Barclay等人[18]证实，木质素芳香环上的取代基类型和数量对其抗菌性能有决定性影响，其中酚羟基被广泛认为是影响抗菌活性的关键功能基团。Matos等人[19]和Yun等人[20]报告称，低分子量和高酚羟基含量的木质素对包括革兰氏阴性细菌（如Escherichia coli和Salmonella）和革兰氏阳性细菌（如Streptococcus和Staphylococcus aureus）在内的多种病原体具有更强的抗菌活性。然而，由于不同微生物的生理特性多样，不存在适用于所有微生物的通用结构-活性关系[21]。与之前研究中使用的异养细菌不同，A. ferrooxidans是一种独特的嗜酸自养岩石栖息微生物。它的生存依赖于独特的铁氧化呼吸链和耐酸的外膜。这些特性，加上其栖息地中的极端pH条件调节了木质素的离子化状态，表明在这种情况下，抑制机制可能与中性环境中的情况有根本不同。因此，木质素对A. ferrooxidans的具体结构-活性关系仍然是一个重要的知识空白，其背后的分子机制几乎未知。填补这一空白至关重要，因为它对于选择或制备高抗菌活性的木质素、从而提高AMD控制效果具有重要意义。

在这项研究中，详细探讨了木质素在抑制A. ferrooxidans活性方面的结构-活性关系。阐明了木质素在转录水平上破坏A. ferrooxidans的复杂机制。研究发现，低分子量的木质素对A. ferrooxidans具有更强的抑制作用，主要是通过生成活性氧（ROS）实现的。此外，木质素还通过破坏关键生理途径（包括膜生物合成、碳水化合物代谢和信号转导）导致细胞损伤和细菌死亡。这项研究为开发高性能木质素提供了可行的见解，以限制A. ferrooxidans的活性，并有助于理解木质素对抗A. ferrooxidans的作用机制。这些发现代表了AMD管理策略的进步。

部分摘录

使用丙酮/水溶液对木质素进行分级

从Aladdin Scientific（中国上海）购买的碱性木质素按原样使用，按照Domínguez-Robles等人[22]建立的方案用丙酮-水溶液进行分级（图1）。简而言之，10克木质素分散在100毫升60%（v/v）的丙酮-水溶液中，并磁力搅拌60分钟以确保完全分散。之后，将混合物以8000 rpm的速度离心30分钟，收集上清液。不溶性的木质素

木质素分级物的产率、分子量和酚羟基含量分析

获得具有不同结构特征的木质素是研究其在抑制A. ferrooxidans活性方面结构-活性关系的前提。这里采用了一种简单的丙酮/水溶液分级方案来实现木质素的结构变化。原始木质素通过不同浓度的丙酮/水溶液进行连续分级，得到三个分级物（SⅠ、SⅡ和SⅢ）。SⅠ、SⅡ和SⅢ分级物的产率分别进行了测定

结论

我们之前的研究首次证明了木质素是一种高效的杀菌剂，可以抑制硫化物矿物的生物氧化，从而防止AMD的形成。在此基础上，本研究进一步深入探讨了木质素的结构-活性关系及其对A. ferrooxidans的分子抑制机制。研究发现，低分子量的木质素具有更强的抗菌活性，主要是通过诱导大量ROS的产生

未引用的参考文献

[2], [3], [4], [5]; [8], [9]; [42], [43]

CRediT作者贡献声明

Haina Cheng: 实验研究。Hongbo Zhou: 架构设计。Lizhen Jia: 实验研究、数据管理。Dumengfei Chen: 实验研究。Yuguang Wang: 实验研究。CHEN ZHU: 文章撰写——审稿与编辑、实验研究、资金获取、架构设计。Binyuan Gao: 文章撰写——初稿、方法学研究、实验研究、数据管理。Zhuoran Dong: 实验研究、数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号52574220）、湖南省自然科学基金（项目编号2024JJ6522）和中南大学启动资金的支持。