《Advanced Science》：Extracellular Vesicles of Streptococcus anginosus Mediate Gastritis via Epithelial Barrier Disruption and Macrophage-driven Inflammation
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本文揭示了咽峡炎链球菌（SA）来源的胞外囊泡（EVs）在非幽门螺杆菌（H. pylori）胃炎中的关键致病作用。研究发现SA-EVs携带毒力蛋白TMPC和FBP62，可破坏胃上皮紧密连接（如Claudin-18, Occludin, ZO-1），激活MAPK信号通路（p-ERK1/2, p-JNK, p-AKT），并诱导巨噬细胞为中心的炎症反应（上调TNF-α, IL-6, IL-17A等细胞因子），同时导致肠道菌群失调和天冬氨酸代谢紊乱。该研究为SA相关胃病的机制提供了新见解，并提示TMPC和FBP62可作为潜在治疗靶点。
2.1 SA-EVs在胃黏膜积累并被上皮细胞内化
研究表明，咽峡炎链球菌（SA）可在胃黏膜定植。本研究成功从SA培养上清中分离出SA来源的胞外囊泡（SA-EVs），其直径约为100纳米，富含脂磷壁酸（LTA）。细胞实验证实，SA-EVs可被胃上皮细胞（GES-1）内化。小鼠体内实验通过荧光成像显示，灌胃给予的SA-EVs可在胃组织中持续积累超过24小时，表明SA-EVs能特异性靶向并滞留于胃组织。
2.2 短期SA-EVs暴露诱发急性胃炎和促炎细胞因子产生
小鼠每隔两天灌胃SA-EVs，持续两周。荧光原位杂交（FISH）在SA-EVs处理组小鼠胃黏膜基底区检测到SA DNA，表明其在体内的定位。组织学分析显示，SA-EVs处理的小鼠出现急性炎症，伴有显著炎性细胞浸润。67%的小鼠出现轻度炎症。血清中促炎细胞因子（TNF-α, IL-6, IL-17A, MCP-1, IL-12, IFN-α, IL-1β, MIP-1α）水平显著升高，证明SA-EVs能诱导急性胃炎症并上调促炎因子。
2.3 慢性SA-EVs暴露导致持续性胃炎伴上皮屏障破坏
建立慢性感染模型，小鼠在三个月内每隔两天灌胃SA-EVs。FISH证实SA-EVs在实验期间持续定位于胃黏膜。组织学分析显示，SA-EVs和H. pylori处理的小鼠均出现慢性炎症，伴有持续的中性粒细胞浸润和淋巴细胞聚集。SA-EVs处理组小鼠胃炎症评分显著高于PBS对照组。促炎细胞因子（IL-17A, CCL20, IL-6, IL-12, CCL8, TNF-α）水平显著升高。流式细胞术和ELISA分析进一步证实胃组织中IL-17A和TNF-α等炎症因子显著增加，表明SA-EVs能诱发持续的胃部炎症。
2.4 SA-EVs破坏胃屏障功能并改变小鼠胃菌群稳态
SA-EVs促进上皮细胞增殖（Ki-67和PCNA表达增加），但对抗凋亡无显著影响。免疫荧光染色和Western blot分析显示，SA-EVs感染三个月后，胃特异性紧密连接蛋白（Claudin-18, Occludin, ZO-1）表达显著下调。组织学分析显示阿辛蓝阳性细胞增加，胃内因子（GIF）阳性的壁细胞减少。这些结果表明SA-EVs损害上皮完整性，破坏黏膜屏障功能。
2.5 SA-EVs蛋白质组含有毒力因子TMPC和FBP62并激活MAPK信号
液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析鉴定出SA和SA-EVs中共有的539种蛋白质，其中TMPC是丰度最高的前五种蛋白之一。Western blot实验证实，SA-EVs处理的小鼠胃组织中p-ERK1/2, p-JNK, p-AKT蛋白表达显著增加，表明SA-EVs可能作为递送TMPC的载体。FBP62也在SA-EVs中被检测到。此外，SA-EVs处理组TLR2表达也增加。这些发现提示SA-EVs通过携带毒力因子TMPC和FBP62，激活MAPK信号通路，参与胃炎的发病机制。
2.6 SA-EVs在胃中触发以巨噬细胞为中心的细胞因子信号
对SA-EVs灌胃三个月后的小鼠胃组织进行转录组学分析，发现与PBS组相比基因表达存在显著差异。与炎症和巨噬细胞极化调控相关的基因（如IL-23a, IL-6, IL-2, Ccl8, Ccl4, Spp1, Arg2）显著上调。通路富集分析显示细胞因子-细胞因子受体相互作用和Th17细胞分化通路被激活。qPCR验证了这些关键炎症和巨噬细胞相关基因的上调。流式细胞术进一步显示SA-EVs组胃组织中巨噬细胞数量显著增加，并伴有CD206和F4/80表达升高。这些结果表明SA-EVs暴露引发了涉及巨噬细胞招募和极化的持续炎症程序。
2.7 SA-EVs重塑粪便代谢组和肠道微生物群落
粪便代谢组学分析显示，SA-EVs处理组小鼠粪便代谢物与PBS组相比存在显著差异，天冬氨酸水平显著升高。代谢通路富集分析发现与胃炎相关的通路紊乱，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，精氨酸生物合成等。整合分析显示胃转录组和非靶向粪便代谢组在蛋白消化吸收和代谢通路上调。16S rRNA测序发现SA-EVs处理改变了肠道微生物组成和丰富度（Chao1和Shannon指数降低），并观察到特定微生物类群相对丰度的改变，SA的丰度在SA-EVs处理3个月组高于2周组。qPCR进一步证实了SA的增多。这些发现表明SA-EVs系统性重编程了肠道菌群，这种菌群失调与SA-EVs对胃黏膜的直接作用共同促进了胃炎进展。
2.8 敲除SA的Tmpc和Fbp62基因显著降低其致病性
构建了Tmpc或Fbp62基因敲除的SA突变株（单敲和双敲）。Western blot验证了突变株中相应蛋白的缺失。用突变株来源的EVs灌胃小鼠两周后，H&E染色显示，与野生型SA-EVs相比，缺失TMPC或FBP62（尤其是双敲）的EVs诱导的胃病理显著减轻。血清促炎细胞因子（TNF-α, IL-6, IL-17A等）水平大幅降低。免疫荧光显示敲除组胃组织中SA定植减少，F4/80+巨噬细胞浸润也显著减少。这些结果直接证明TMPC和FBP62是SA-EVs介导胃上皮损伤、炎症激活和巨噬细胞极化的关键毒力因子。
3 讨论
本研究确立了SA-EVs在胃炎发病机制中的重要作用。SA-EVs通过携带TMPC和FBP62等毒力因子，破坏胃上皮屏障，激活MAPK信号通路和巨噬细胞主导的炎症反应，并引起肠道菌群失调和天冬氨酸代谢紊乱，共同驱动急慢性胃炎的发生发展。基因敲除实验功能性地验证了TMPC和FBP62的关键作用。这项工作拓宽了对细菌性胃炎发病机制的认识，突出了EVs作为宿主-病原体相互作用动态载体的重要性，为针对细菌EVs诊断和治疗胃肠道疾病提供了新的基础。
4 实验部分/方法
本研究涉及了细菌培养与EV分离、透射电子显微镜（TEM）和囊泡大小测量、Western Blot、细胞摄取实验、SA-EVs小鼠感染模型、荧光原位杂交（FISH）、组织学评估、胃组织免疫细胞纯化、流式细胞术、免疫组织化学（IHC）染色、阿辛蓝染色、免疫荧光（IF）染色、LC-MS/MS分析、转录组学分析、非靶向代谢组学分析、16S rRNA测序、血清ALT、AST和ALB检测、SA的△Tmpc和△Fbp62菌株构建、DNA提取与电泳、TMPC和FBP62蛋白纯化、抗TMPC和FBP62抗体制备以及统计学分析等多种实验方法，为结论提供了坚实的实验数据支持。
