《Advanced Science》：NuSAP Safeguards Centriole Integrity to Mediate CEP57-CEP152 Torus Recruitment for Proper Engagement
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本文揭示了微管相关蛋白NuSAP在维持中心粒结构完整性中的新功能。研究发现NuSAP通过其微管结合结构域（MTBD）直接相互作用CEP57，并招募CEP57-CEP63-CEP152环状复合物到新生中心粒（procentriole）近端，从而确保中心粒正确结合（engagement）及中心粒周围物质（PCM）的稳定组装。该研究不仅阐明了NuSAP在G2期防止中心粒过早解离（disengagement）的关键作用，还为理解微管稳定性如何调控中心体组织提供了新视角。
1 引言
中心体作为动物细胞中主要的微管组织中心，在纺锤体组装、染色体分离及基因组稳定性维持中发挥关键作用。中心体周期与中心粒复制及结合动力学紧密偶联，其中中心粒正确“结合”状态对防止多极纺锤体形成及非整倍体至关重要。CEP57–CEP63–CEP152模块在中心粒近端形成环状支架，是维持中心粒结合、成熟及复制许可的核心蛋白复合体。NuSAP是一种RanGTP调控的微管相关蛋白，作为重要的微管稳定因子参与有丝分裂纺锤体完整性维持。近年研究发现，NUSAP1基因突变与小头畸形等神经发育障碍相关，提示其在中心体功能中可能具有重要作用。
2 结果
2.1 NuSAP缺失诱导G2期中心粒过早解离
利用超分辨率显微镜技术，本研究发现NuSAP定位于中心粒。在G2期同步化的HeLa细胞中，NuSAP敲除（KO）导致中心粒过早解离的比例显著增加（从4.5±1.9%增至18.1±4.1%）。通过超微结构扩展显微镜（U-ExM）分析进一步证实，NuSAP-KO细胞中中心粒结合状态异常，表现为中心粒间距与角度参数异常。这些结果说明NuSAP是维持G2期中心粒正确结合所必需的。
2.2 NuSAP缺失引起中心粒周围物质紊乱
中心粒周围物质（PCM）的完整性对中心粒结合至关重要。免疫荧光结果显示，WT细胞中pericentrin形成紧密环状结构，而NuSAP-KO细胞中pericentrin呈弥散分布或多焦点异常。定量分析表明，NuSAP-KO细胞中正常PCM结构的比例从86.3±2.1%降至33.7±3.1%。CEP192等核心PCM蛋白的定位也出现类似紊乱，说明NuSAP缺失导致PCM组织结构破坏。
2.3 正常细胞中NuSAP敲低同样导致中心粒解离与PCM紊乱
为排除癌细胞特异性，研究在ARPE19细胞（正常视网膜色素上皮细胞）中敲低NuSAP，发现同样出现中心粒解离与PCM结构紊乱。这表明NuSAP在维持中心体完整性方面具有普适性功能，而非癌细胞特有现象。
2.4 NuSAP通过其MTBD结构域与CEP57相互作用
通过TurboID邻近标记技术，本研究筛选出NuSAP的相互作用蛋白，并发现CEP57是NuSAP的直接结合伙伴。免疫共沉淀（Co-IP）实验显示，NuSAP的微管结合结构域（MTBD）是与CEP57结合的关键区域。体外pull-down实验进一步证实两者之间存在直接相互作用。此外，CEP57的N端区域对其与NuSAP的结合起主要作用。
2.5 NuSAP定位于中心粒
免疫荧光与U-ExM分析显示，内源性和外源性NuSAP均定位于中心粒微管壁。正交视图下的强度分析表明，NuSAP位于中心粒微管壁（乙酰化α-tubulin标记）与CEP57环之间，提示其可能作为连接中心粒结构与PCM的分子桥梁。
2.6 NuSAP缺失破坏中心粒微管结构
STED超分辨显微镜显示，NuSAP-KO细胞中中心粒微管结构发生显著紊乱，虽然中心粒平均半径无显著变化，但圆度值降低（从0.933±0.032降至0.857±0.025），表明中心粒几何形状的规则性受损。3D重构进一步证实NuSAP缺失导致中心粒微管壁不连续及结构扭曲。
2.7 NuSAP对CEP57在新生中心粒上的正确招募至关重要
时序观察显示，在S期至G2期进程中，WT细胞的中心粒逐渐招募CEP57，形成环状结构；而NuSAP-KO细胞中CEP57在新生中心粒上的招募明显受损。同时，CEP63与CEP152的定位也出现类似异常，说明NuSAP缺失影响了整个CEP57-CEP63-CEP152环状复合体的组装。
2.8 NuSAP缺失降低中心体内CEP57蛋白水平
通过蔗糖密度梯度离心分离中心体，免疫印迹分析显示，虽然总细胞中CEP57蛋白水平无变化，但中心体组分中CEP57水平在NuSAP-KO细胞中显著降低（降低约35.8%），表明NuSAP specifically影响CEP57在中心体的定位而非表达。
2.9 中心粒微管结构破坏导致CEP57错误定位
为区分NuSAP的作用是否依赖于微管结构稳定性，研究使用Vinblastine处理WT细胞以破坏微管结构。结果显示，Vinblastine处理可模拟NuSAP缺失表型，引起中心粒解离与CEP57错误定位。相反，在NuSAP-KO细胞中使用Taxol稳定微管结构，并不能恢复CEP57的正确定位，说明NuSAP本身是CEP57招募的必要条件，而非仅通过维持微管稳定性间接发挥作用。
2.10 回补NuSAP及其MTBD可挽救PCM紊乱
在NuSAP-KO细胞中回补全长的NuSAP或单独其MTBD结构域，均可有效恢复PCM组织及CEP57在新生中心粒上的定位；而回补缺失MTBD的NuSAP突变体则无此挽救效果。值得注意的是，过表达CEP57本身不能挽救其在NuSAP-KO细胞中的错误定位，进一步确认NuSAP位于CEP57上游发挥调控作用。
2.11 NuSAP是CEP57锚定于新生中心粒的必要条件
U-ExM分析显示，回补NuSAP全长相或其MTBD均可显著恢复CEP57在中心粒上的定位覆盖率（约41%-44%），而回补ΔMTBD突变体或单独过表达CEP57均无法有效挽救。这些结果证明NuSAP及其MTBD是CEP57正确锚定于中心粒的关键因子。
2.12 NuSAP缺失诱导中心粒过早成熟及细胞衰老
在HeLa细胞中，NuSAP缺失导致中心粒过早成熟（表现为CEP164阳性）。在ARPE19细胞中，NuSAP敲低诱导细胞衰老（β-半乳糖苷酶活性升高）。研究还发现，中心粒解离后，CEP57的招募存在NuSAP非依赖性机制，该机制依赖于CEP135；而CEP135敲低则消除了解离中心粒上CEP57的定位。
3 讨论
本研究系统阐明了NuSAP在中心粒结合及PCM组织中的关键作用。基于实验结果，我们提出一个两步骤招募模型：在S/G2期，NuSAP依赖性的CEP57招募是中心粒正确结合及PCM组织所必需的；而在中心粒解离后，存在CEP135依赖的NuSAP非依赖性招募机制，确保中心粒成熟及复制许可。该研究不仅揭示了MAPs在中心体结构维护中的新功能，也为理解中心体相关疾病（如小头畸形）的分子机制提供了重要线索。
