《Advanced Science》：Injectable Chondroitin Sulfate Methacrylate Hydrogel Microspheres Co-Loaded with GLPM Nanozyme, Dexamethasone, and Stem Cells for Synergistic Osteoarthritis Therapy
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本文报道了一种创新的可注射水凝胶微球平台，该平台集成了抗氧化（活性氧（ROS）清除）、抗炎（持续释放地塞米松（Dsp））和再生（共递送骨髓间充质干细胞（BMSCs））功能，用于骨关节炎（OA）的局部协同治疗。该ChSMA（硫酸软骨素甲基丙烯酸酯）微球通过微流控光交联技术制备，具有均匀尺寸（~125 μm）和炎症响应性降解特性。研究表明，该微球能有效清除ROS、诱导巨噬细胞向M2表型极化、抑制促炎细胞因子（TNF-α, IL-6等降低约70%），并在大鼠OA模型中显著减轻软骨侵蚀、减少骨赘体积（降低80%）和改善软骨下骨微结构，OARSI评分降低88%。该研究为OA的微创综合治疗提供了新策略。
可注射多功能水凝胶微球的开发背景与目标
骨关节炎（OA）是一种全球高发的退行性关节疾病，以软骨降解、慢性炎症和软骨下骨重塑为特征。传统的关节腔内（IA）治疗方法，如皮质类固醇注射和粘性补充，仅能提供短暂的症状缓解，缺乏疾病修饰作用。OA发病机制中，氧化应激是关键驱动因素，关节微环境中活性氧（ROS）（如超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢（H2O2））水平升高，导致细胞组分氧化损伤、软骨细胞凋亡和细胞外基质（ECM）加速降解。此外，过量ROS激活核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等促炎信号通路，放大滑膜炎症。同时，关节软骨有限的再生能力也是有效治疗面临的挑战。骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）和硫酸软骨素（ChS）因其成软骨潜力、免疫调节作用和基质支持功能而被广泛研究，但其IA应用存在细胞存活率低、关节滞留差和植入不足等问题。水凝胶基IA递送系统因其能提供局部、持续释放并模拟天然ECM而受到关注。本研究旨在开发一种多功能可注射水凝胶微球平台，用于OA的IA治疗，整合ROS清除、抗炎药物递送和基于干细胞的软骨再生。
GLPM纳米酶的表征与抗氧化活性
灵芝多糖（GLP）还原的MnO2纳米颗粒（GLPM）通过GLP与KMnO4之间的氧化还原反应合成。紫外-可见（UV-vis）光谱、傅里叶变换红外（FTIR）光谱、X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）分析证实了GLPM的成功合成及其Mn（IV）氧化态。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）显示GLPM为均匀的椭球形颗粒，平均直径约120 nm，动态光散射（DLS）显示其平均流体动力学直径约为130 nm，分布狭窄。稳定性研究表明GLPM在各种生理介质中具有良好的胶体稳定性。GLPM表现出强大的抗氧化活性，能有效清除羟基自由基（·OH）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）自由基和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS+·）阳离子自由基，表明其作为纳米酶具有广谱自由基清除能力，可调节OA关节内的氧化应激。
ChSMA水凝胶微球的合成与表征
通过甲基丙烯酸酐（MAA）与ChS的羟基和胺基反应合成了可光交联的ChSMA，质子核磁共振（1H NMR）证实了甲基丙烯酸酯基团的成功接枝，修饰度为21.8%。采用UV辅助微流控乳液技术制备了负载GLPM和Dsp的ChSMA微球（GLPM/Dsp@ChSMA）。光学显微镜和SEM显示微球呈均匀球形，平均直径约为125 μm，具有高度多孔的互连网络结构，平均孔径约为20 μm，有利于营养扩散、治疗剂负载和细胞粘附。能量色散X射线光谱（EDS） mapping证实了磷（来自Dsp）和锰（来自GLPM）在微球基质中的均匀分布，表明纳米酶和抗炎药物成分的有效共负载。
微球的机械性能、润滑性及降解与释放行为
注射性评估表明，微球在通过25 G针头注射后能保持球形形态，无可见表面开裂或变形，表明其能承受剪切应力和机械挤压。单颗粒压缩测试显示，GLPM@ChSMA微球比ChSMA微球具有更低的峰值力和更宽的载荷分布，表明GLPM负载增强了弹性。摩擦学测试表明，GLPM@ChSMA微球显著降低了摩擦系数（COF），比磷酸盐缓冲盐水（PBS）或单纯ChSMA降低了约46.7%，这归因于微球的弹性和滚动行为。降解研究表明，微球在生理条件下降解最小，但在氧化应激条件下降解显著加速，这归因于GLPM纳米酶的ROS清除活性。药物释放动力学显示，Dsp在28天内持续释放，累积释放量约为80%，具有轻微的突释效应和后续的扩散主导的持续释放阶段。溶胀行为显示微球具有高溶胀能力，10分钟内溶胀比约为1300%，6小时后达到平衡（约2400%）。
生物相容性、抗氧化功效及免疫调节作用
溶血实验和细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验表明GLPM纳米颗粒和GLPM/Dsp@ChSMA微球具有良好的生物相容性。Calcein-AM/PI染色证实了与大鼠软骨细胞和RAW 264.7巨噬细胞共培养后的高细胞活力。细胞摄取研究表明，Cy5.5标记的GLPM纳米颗粒能被RAW 264.7细胞随时间依赖性摄取。阿尔新蓝染色显示，与空白对照组和ChSMA组相比，用GLPM@ChSMA微球培养的软骨细胞在3、7和14天时硫酸化糖胺聚糖（sGAG）沉积显著增强。免疫荧光分析表明，用GLPM/Dsp@ChSMA提取物处理脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7细胞，可显著减少诱导型一氧化氮合酶（iNOS）荧光并上调CD206（M2巨噬细胞标志物），表明巨噬细胞向抗炎M2表型极化。DCFH-DA染色显示，GLPM/Dsp@ChSMA微球能显著降低LPS刺激的软骨细胞和RAW 264.7细胞内的ROS水平。酶联免疫吸附试验（ELISA）分析表明，GLPM/Dsp@ChSMA微球处理能显著下调LPS刺激的RAW 264.7细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和IL-1β等促炎细胞因子水平（约降低70%），并上调抗炎细胞因子IL-10（约增加90%）。
3D细胞相容性与干细胞负载能力
Calcein-AM/PI染色显示，在冻干和非冻干GLPM/Dsp@ChSMA微球上三维（3D）培养的软骨细胞均表现出高活力。与未冻干的微球相比，冻干微球显示出增加的细胞粘附和铺展。细胞骨架染色和3D重建显示，与大鼠BMSCs共培养48小时后，肌动蛋白（F-actin）组织良好并在微球表面延伸，细胞核均匀分布，表明微球为干细胞整合提供了机械支持和拓扑有利的环境。
体内治疗疗效评估
在碘乙酸单钠（MIA）诱导的大鼠OA模型中，每周IA注射不同微球制剂，持续5周。DIR荧光示踪显示，GLPM/Dsp/BMSCs@ChSMA微球在IA注射后14天内逐渐降解和清除。微型计算机断层扫描（micro-CT）显示，PBS组关节出现显著骨赘形成、表面粗糙和软骨下骨硬化，而GLPM/Dsp/BMSCs@ChSMA（G4）组关节表面光滑，骨赘形成减少，关节结构保存。定量分析显示，G4组的相对骨赘体积减少至PBS组的约20%，骨体积分数（BV/TV）、骨矿物密度（BMD）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁分离度（Tb.Sp）均显著改善。免疫荧光染色显示，G4组II型胶原表达丰富且分布均匀，而PBS组表达稀疏且紊乱。组织学染色（苏木精-伊红（H&E）和番红O-固绿）显示，G4组软骨表面连续，蛋白聚糖含量恢复，软骨细胞柱状结构良好，而PBS组显示严重软骨侵蚀和蛋白聚糖丢失。骨关节炎研究协会国际（OARSI）和Mankin评分显示，G4组评分显著低于PBS组（OARSI评分降低88%，Mankin评分降低78%）。免疫荧光分析显示，G4组滑膜组织中iNOS表达减少，CD206表达增加，表明巨噬细胞向M2表型极化。ELISA分析显示，G4组血清中促炎细胞因子（TNF-α, IL-6, IL-1β）水平显著降低，抗炎细胞因子IL-10水平升高。主要器官H&E染色和血液学分析证实了该材料系统的生物安全性。
结论
本研究成功开发了一种多功能、可注射的GLPM/Dsp@ChSMA水凝胶微球平台，用于OA的多模式治疗。该平台整合了ROS清除、抗炎药物递送和干细胞介导的软骨再生功能。微球具有良好的生物相容性、机械适应性、炎症响应性降解和持续药物释放特性。体外和体内实验证实，该微球能有效清除ROS、调节免疫微环境（促进M2巨噬细胞极化）、支持软骨细胞和BMSCs的存活与功能，并在OA大鼠模型中显著减轻疾病进展，促进关节结构和功能恢复。该研究为OA的局部微创综合治疗提供了一种有前景的策略。
