智能温控自限性磁热疗联合热触发TERT基因沉默用于精准协同癌症治疗

《Advanced Science》：Intelligent Thermo-Self-Limited Magnetothermia with Heat-Triggered TERT Silencing for Precision Synergetic Cancer Therapy

本文报道了一种新型纳米平台（IONP@H1THs），通过整合超小氧化铁纳米粒子（IONP）与功能DNA，实现了自限性磁热性能与热诱导精准靶向基因编辑的协同。该平台在癌细胞中通过TERT mRNA触发的发夹DNA自组装增强磁热效应，并在达到特定温度时通过温度敏感DNA解链实现自限加热，同时激活Hsp70启动子驱动原位小干扰RNA（siRNA）合成以沉默TERT基因，为温和热疗（MTT）与基因治疗（GT）的精准协同抗癌提供了新策略。

　　

引言：多功能治疗平台整合不同治疗模式在癌症治疗中展现出巨大潜力。热疗因其时空可控的局部消融能力备受关注，但高温（>50°C）易损伤正常组织并引发免疫抑制，而温和热疗（MTT，<45°C）可通过调控细胞周期蛋白和激酶诱导凋亡。然而，MTT疗效有限，且传统温度调控依赖外部参数调整，操作复杂。基因治疗（GT）可调控热耐受相关基因，但存在递送效率低和脱靶风险。本研究旨在开发一种集成自限性磁热疗与热触发精准基因编辑的纳米平台。

纳米平台构建与表征：研究通过配体交换法将油酸修饰的超小IONP（IONP-OA）转化为亲水性的IONP@DA，其粒径为3.2±0.4纳米，晶格条纹间距0.25纳米对应Fe₃O₄的（311）晶面。X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）证实了磁铁矿结构。随后，通过EDC/NHS化学将杂交功能DNA（H₁THs-DNA）偶联至IONP@DA表面，形成IONP@H₁THs纳米平台。该DNA由发夹DNA（H₁-DNA，Tm=46.8°C）、靶向响应DNA（TR-DNA）和Hsp70启动子控制的siRNA前体（Hs-DNA）组成。琼脂糖凝胶电泳验证了TERT编码序列可触发杂交DNA解离。紫外-可见光谱在260纳米处显示DNA特征吸收峰，动态光散射（DLS）表明水合粒径从31纳米增至46纳米，Zeta电位由正转负（-6.1±1.3毫伏），原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）证实DNA成功修饰且纳米粒子保持分散。

响应性组装与自限性磁热效应：研究比较了三种不同Tm值发夹DNA（H₁-DNA、H₂-DNA、H₃-DNA）构建的纳米平台。目标DNA诱导所有平台发生聚集，水合粒径达200-300纳米，而随机核酸无影响。加热曲线显示，升温幅度与发夹DNA的Tm值正相关，其中H₁-DNA在交变磁场（AMF，频率345千赫兹，场强13.1千安/米）下升温6.2°C，适于MTT并激活Hsp70。组装态IONP@H₁THs的磁热性能显著优于单分散态。在铁浓度50-500微克/毫升范围内，单分散平台升温与浓度线性相关，而组装平台在400微克/毫升后升温趋缓，比吸收率（SAR）随浓度增加而下降。在不同场强下（10.8-30.1千安/米），组装平台在20.4千安/米（对应溶液温度>45°C）以上加热性能饱和，与单分散平台差异缩小至0.4°C，表明高温导致DNA解链，减少聚集，从而动态调节磁热性能。SYBR Green I荧光实验显示随温度升高双链DNA减少，DLS证实高温下粒径分布由近高斯型转为非高斯型，存在动态逆自调节关系。

细胞摄取与AMF诱导Hsp70启动子激活：CCK-8实验显示IONP@H₁THs对正常人成纤维细胞（HSF）毒性可忽略，对MDA-MB-231癌细胞在200微克/毫升处理24小时后存活率仍高于80%，后者摄取量更高且TEM显示明显细胞内聚集，可能与TERT过表达有关。以无法聚集的IONP@LTHs为对照，在AMF处理下，IONP@H₁THs+AMF组诱导Hsp70蛋白和mRNA表达显著上调，与直接43°C加热效果相当，而IONP@LTHs+AMF组仅轻微增加。进一步以Hsp70启动子驱动mCherry报告基因验证，IONP@H₁THmC+AMF组在细胞内引发强红色荧光，表明聚集增强磁热效应特异性激活了Hsp70启动子转录。

体外抗肿瘤效应：CCK-8和Calcein-AM/PI染色显示，IONP@H₁THs+AMF处理在48和72小时显著抑制MDA-MB-231细胞增殖，效果优于IONP@H₁T+AMF（缺乏siRNA合成功能）。活性氧（ROS）和凋亡检测表明IONP@H₁THs+AMF诱导最强氧化应激和细胞死亡。免疫荧光、Western blot和qPCR证实该处理特异性下调TERT蛋白和mRNA表达。细胞周期分析显示G0/G1期细胞比例增加，S+G2/M期减少，表明TERT沉默协同磁热疗抑制增殖。

转录组分析与验证：转录组分析显示IONP@H₁THs+AMF处理引起显著基因表达变化，与IONP@H₁T+AMF相比有3362个差异表达基因（DEGs）。GO富集分析显示上调基因涉及免疫受体活性和铁离子代谢（与铁死亡相关），下调基因富集于细胞分裂和黏着斑（FA）相关通路。Western blot验证IONP@H₁THs+AMF下调FAK、Paxillin和RhoA表达。细胞迁移实验表明该处理显著抑制癌细胞迁移，效果优于单纯siRNA处理。

体内Hsp70启动子特异性激活与自限磁热：在MDA-MB-231荷瘤小鼠中，IONP@H₁THmC在AMF场强13.1千安/米下使肿瘤温度升至约42°C，增至20.4千安/米时温度仅微升0.6°C，显示自限性。体内荧光成像显示13.1和20.4千安/米组在24和48小时出现强mCherry荧光，72小时再施AMF后荧光增强，离体成像证实肿瘤局部特异性表达。

体内抗肿瘤效应：在MDA-MB-231荷瘤鼠模型中，IONP@H₁THs+AMF处理显著抑制肿瘤生长，效果优于IONP@H₁T+AMF或siRNA单独处理。H&E和TUNEL染色显示该组肿瘤细胞死亡和凋亡最多，Ki-67表达最低。免疫荧光证实肿瘤组织Hsp70表达上调，TERT下调，且FAK、整合素和RhoA表达同步下降，与体外结果一致。安全性评估显示IONP@H₁THs对肝肾功能和主要器官无显著毒性。

结论：本研究成功构建了一种智能纳米平台，通过TERT mRNA响应性组装增强磁热效应，并利用DNA热敏感性实现自限加热，同时激活Hsp70启动子驱动原位TERT基因沉默，为精准协同癌症治疗提供了新途径。该平台克服了传统热疗过热风险和基因治疗脱靶问题，整合了温和热疗与基因编辑的优势。