《Advanced Science》：miR-135a-5p Is a Promising Target to Prevent the Glomerulosclerosis Associated with Podocyte Developmental Toxicity in Offspring Induced by Prenatal Dexamethasone Exposure
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本文揭示了产前地塞米松暴露（PDE）通过激活糖皮质激素受体（GR）-P300-miR-135a-5p/KLF4表观遗传轴，程序化改变子代肾脏足细胞发育并诱发成年期肾小球硬化的新机制。研究发现，PDE诱导的GR与P300在miR-135a-5p启动子区富集，通过组蛋白乙酰化（H3K9ac等）修饰持续上调miR-135a-5p表达，进而抑制关键转录因子KLF4，损害足细胞分化标志物（Nephrin、Podocin）表达及足突结构。重要的是，生命早期给予miR-135a-5p拮抗剂可部分逆转上述病理改变，提示miR-135a-5p是防治胎儿起源肾小球硬化的潜在靶点。
1 引言
地塞米松作为一种常见的合成糖皮质激素，因其强大的抗炎和抗过敏特性被广泛用于临床医学和畜牧业。此外，地塞米松广泛用于早产孕妇以促进胎儿肺成熟并降低新生儿死亡率。世界卫生组织2014年的一项调查发现，各国孕妇产前糖皮质激素治疗的平均比率为54%，最高比率达到91%。然而，孕期母体地塞米松暴露对子代健康的影响仍备受关注。研究发现，孕期母体地塞米松暴露可增加子代疾病易感性，甚至导致疾病发生。对于这种胎儿源性健康危害的发生机制及具体防治措施的研究尚未取得有效突破。
足细胞是与基底膜通过独特足突紧密结合的肾小球上皮细胞，从而形成调节血液和尿液之间物质选择性过滤的裂孔隔膜。足细胞提供机械支撑并防止蛋白质和大分子泄漏，因此对于维持肾小球滤过屏障的完整性至关重要。足细胞损伤或凋亡导致滤过屏障功能障碍，是许多肾脏疾病的重要致病因素。肾小球硬化是一种以肾小球玻璃样变性为特征的临床病理综合征，主要临床表现为蛋白尿和肾功能进行性恶化。由于足细胞是终末分化细胞，它们在分化和成熟后不可再生，其数量在很大程度上取决于其胚胎发育。流行病学数据显示，低出生体重个体的肾足细胞数量显著减少，并且在成年期患肾小球疾病的风险增加。值得注意的是，初步证据表明产前糖皮质激素暴露可能通过改变表观遗传编程影响肾脏发育，尽管其在足细胞谱系特化中的具体作用尚不清楚。在我们之前的研究中，我们发现PDE可导致成年大鼠子代肾小球硬化，但其机制尚未阐明。已证实足细胞损伤是导致肾小球硬化的始动因素。因此，我们假设PDE诱导的肾小球硬化可能与足细胞发育毒性有关。
MicroRNAs（miRNAs）是一类广泛存在于生物体中的小非编码RNA，通过在转录后水平负调控靶基因表达，主要通过靶向信使RNA（mRNAs）。最近的研究表明，miRNAs在调节多种组织和器官（包括肾脏）的发育和功能中起关键作用。越来越多的证据表明，miRNAs可能通过调节与细胞分化、增殖、凋亡和细胞骨架动力学相关的基因来介导足细胞损伤。然而，它们在足细胞发育中的作用和潜在机制尚未详细阐明。深入了解特定miRNA在足细胞发育中的作用及其对毒性暴露的反应，可能揭示肾脏发育毒性的新机制，并可为预防或减轻肾脏疾病提供潜在的治疗靶点。
在本研究中，我们从地塞米松诱导的miRNA表观遗传改变介导足细胞发育毒性的角度深入研究了PDE诱导子代肾小球硬化宫内编程的机制。此外，我们通过对PDE子代进行miRNA干预，研究了与PDE诱导的足细胞发育毒性相关的胎儿源性肾小球硬化的防治。本研究可为揭示胎儿源性肾脏疾病的机制和探索地塞米松发育肾毒性的有效防治策略提供理论和实验证据。
2 结果
2.1 PDE导致子代大鼠肾足细胞发育毒性
为了研究PDE对子代肾脏足细胞发育的影响，我们检测了子代出生前（孕第20天，GD20）和出生后不同时间点（出生后第6周和第28周，PW6和28）的肾脏形态学和足细胞发育指标。形态学结果显示，与对照组相比，PDE组表现出胎儿肾脏发育不良，表现为皮质区和生肾区显著变薄，成熟肾小球数量明显减少，肾小球鲍曼囊空虚，毛细血管网络发育不良。在PW28时，PDE组显示肾小球增生，基底膜增厚，鲍曼囊腔狭窄和局灶性肾小球硬化。上述结果与之前的研究结果一致，表明PDE导致胎儿肾脏发育不良和成年期肾小球硬化。进一步，我们检测了足细胞形态和发育的相关指标。蛋白质印迹和免疫荧光结果显示，在GD20（产前）、PW6（青春期）和PW28（成年期），PDE组足细胞功能基因Nephrin和WT1的蛋白表达均显著降低。在电子显微镜下，GD20和PW28时PDE组的肾脏均显示肾小球基底膜增厚，足突大面积融合或消失，足突数量显著减少。上述结果表明PDE导致子代肾足细胞形态和功能发育不良，且这种不良影响持续到子代成年期。
地塞米松可以穿过胎盘进入胎儿体内。因此，我们假设PDE诱导的子代足细胞发育毒性可能与地塞米松的直接毒性有关。因此，我们构建了体外足细胞分化模型，并利用该细胞模型探讨地塞米松对足细胞分化的影响。使用Wnt4（100 ng/mL）处理3天以诱导原代后肾间充质干细胞（MMSCs）向足细胞定向分化。流式细胞术检测显示分化足细胞的阳性率为96.7%。同时，与未分化的MMSCs相比，Nephrin和Podocin的mRNA表达均显著升高，表明足细胞定向分化模型成功建立。随后，基于足细胞分化模型，在同一时间用不同浓度的地塞米松处理细胞。MTS结果显示，在0–2500 nM浓度范围内，地塞米松处理3天对细胞活力没有影响。逆转录定量PCR（RT-qPCR）结果显示，地塞米松显著降低了Nephrin和Podocin的mRNA水平。上述结果表明地塞米松可以直接抑制足细胞分化，从而导致子代足细胞发育毒性。
2.2 改变的miR-135a-5p/ Kruppel样因子4（KLF4）表达介导PDE诱导的子代大鼠足细胞发育受损
KLF4主要在上皮细胞包含的组织中表达，并已被发现在胎儿和成人肾脏中大量表达。KLF4通过上调Nephrin、WT1和Podocin的表达来促进足细胞发育并维持足细胞表型。为了探索PDE抑制子代肾足细胞表型基因表达的机制，我们检测了从宫内到产后不同时间点子代肾脏中KLF4的表达。结果显示，在GD20、PW6和PW28时，PDE组子代肾脏的KLF4 mRNA和蛋白表达均显著低于对照组，表明PDE可能通过抑制子代肾脏中KLF4的表达来抑制足细胞表型。在细胞水平上，我们发现地塞米松显著降低了足细胞分化模型中KLF4的mRNA和蛋白表达。进一步，我们利用KLF4过表达质粒转染MMSCs，发现地塞米松对Nephrin mRNA和蛋白表达的抑制作用被KLF4过表达所逆转。上述结果表明地塞米松可能通过抑制KLF4来介导足细胞发育毒性。
据报道，KLF4与miRNAs密切相关，其表达易受miRNA调控。为了探索PDE抑制KLF4的机制，我们基于文献和Targetscan数据库预测筛选了一系列可能靶向KLF4的miRNAs，并在胎儿和成年子代肾脏中进行了检测。结果显示，仅在GD20、PW6和PW28所有时间点，PDE组miR-135a-5p的表达显著高于对照组。提取子代胎儿（GD20）的肾脏MMSCs进行检测发现，与对照组相比，PDE子代胎儿MMSCs中miR-135a-5p的表达增加。在成年子代肾脏的miR-135a-5p原位杂交实验结果中，虽然我们发现miR-135a-5p不仅表达于足细胞，但通过miR-135a-5p与足细胞标志物Nephrin的共染色，发现miR-135a-5p信号与肾小球内的足细胞区域高度重叠。此外，PDE成年子代足细胞中miR-135a-5p的表达高于对照组。这一结果表明miR-135a-5p可能与PDE诱导的子代肾足细胞发育毒性密切相关。有趣的是，我们还发现PDE组成年雄性子代（PW28）外周血单个核细胞（PBMC）中miR-135a-5p的表达高于对照组。体外实验显示，地塞米松处理显著升高了MMSCs中miR-135a-5p的表达。此外，在细胞中转染miR-135a-5p抑制剂质粒后，地塞米松对KLF4和Nephrin蛋白表达的抑制作用被逆转。综上所述，这表明地塞米松通过上调miR-135a-5p抑制KLF4表达，从而抑制足细胞分化和发育。
2.3 高组蛋白乙酰化/ miR-135a-5p表达参与介导PDE子代大鼠足细胞发育毒性
表观遗传修饰是宫内编程的关键机制，组蛋白修饰是此类修饰的常见形式。miR-135a-5p的高表达从产前持续到成年子代，表明该机制可能与表观遗传调控有关。通过Cistrome Data Browser预测，miR-135a-5p启动子区域最可能的组蛋白表观遗传形式是组蛋白乙酰化。因此，我们检测了不同时间点子代肾脏miR-135a-5p启动子区域的组蛋白乙酰化水平和甲基化水平。结果显示，在GD20、PW6和PW28时，与对照组相比，PDE组子代肾脏miR-135a-5p启动子区域的H3K9ac水平显著升高，表明高水平的H3K9ac从宫内携带到产后。这些发现支持PDE诱导子代肾脏miR-135a-5p高表达编程改变的机制可能与miR-135a-5p启动子区域H3K9ac水平升高有关。
接下来，我们在细胞水平探讨地塞米松是否能直接诱导miR-135a-5p的编程变化。在足细胞分化模型中，用地塞米松处理细胞3天，然后在地塞米松撤除后继续培养细胞3天或7天。结果显示，与对照组相比，地塞米松撤除后3天和7天，miR-135a-5p的表达仍然显著较高，而下游基因KLF4、Nephrin和Podocin的表达显著较低。上述结果表明地塞米松对miR-135a-5p表达的上调具有持久效应，与体内结果一致。进一步，为验证表观遗传通路参与介导miR-135a-5p高表达编程，我们检测了地塞米松处理MMSCs后miR-135a-5p启动子的组蛋白乙酰化水平。结果显示地塞米松显著上调了miR-135a-5p的H3K9ac、H3K14ac和H3K27ac水平。综上所述，我们推测地塞米松通过上调miR-135a-5p的组蛋白乙酰化水平，导致miR-135a-5p高表达编程，从而介导足细胞发育毒性。
2.4 糖皮质激素受体（GR）/P300介导PDE子代大鼠miR-135a-5p组蛋白高乙酰化
地塞米松主要通过与GR结合，促进GR进入细胞核，并与靶基因的糖皮质激素反应元件（GRE）结合来调节靶基因表达。通过JASPAR软件预测了miR-135a-5p启动子区域存在GRE。为验证此预测结合，我们使用HEK293T细胞建立了miR-135a-5p启动子荧光素酶报告基因系统。发现共转染GR质粒和miR-135a-5p启动子序列后，荧光素酶活性增强，表明miR-135a-5p启动子区域存在GRE。
研究表明，GR募集转录共激活因子P300至靶基因启动子区域，并通过组蛋白乙酰化修饰 loosening 染色质的超螺旋结构来促进基因转录。为探索PDE上调miR-135a-5p组蛋白乙酰化水平的分子机制，我们检测了胎儿肾脏中GR和P300的mRNA表达，发现与对照组相比，PDE组均显著上调。此外，GR和P300在miR-135a-5p启动子区域的富集显著增强。在体外，我们发现用不同浓度的地塞米松处理大鼠MMSCs导致GR和P300的mRNA表达和核内蛋白表达显著增加。ChIP-qPCR结果显示，在地塞米松处理的MMSCs中，GR和P300在miR-135a-5p启动子区域的富集显著增加。Co-IP测定结果也显示，与对照组相比，地塞米松处理的细胞中P300与GR的结合增强。进一步，我们使用siRNA敲低MMSCs中GR或P300的表达，发现敲低GR或P300逆转了地塞米松诱导的H3K9ac水平升高、GR或P300向miR-135a-5p启动子区域的富集、miR-135a-5p表达的上调以及KLF4和Nephrin表达的下调。这些结果表明地塞米松可能促进GR结合miR-135a-5p启动子并招募P300，增加启动子乙酰化和miR-135a-5p转录。
2.5 体内干预miR-135a-5p可逆转PDE子代肾足细胞损伤和肾小球硬化
最后，为探讨miR-135a-5p是否可作为早期干预PDE诱导的足细胞发育毒性的靶点，我们从PW1至PW5对雄性PDE子代小鼠施用miR-135a-5p拮抗剂。在PW6和PW28检测形态学和足细胞相关指标。我们发现miR-135a-5p拮抗剂逆转了PW6和PW28时miR-135a-5p表达的升高以及PDE诱导的KLF4、Nephrin和Podocin的下调，并增加了KLF4和Nephrin的蛋白表达。施用miR-135a-5p拮抗剂也减轻了PDE诱导的肾小球增生和硬化，并降低了PW28时的肾小球硬化指数（GSI）。虽然对血清肌酐水平没有显著的逆转作用。综上所述，这些数据表明生命早期干预miR-135a-5p可以部分逆转PDE诱导的成年子代肾足细胞损伤和肾小球硬化。
3 讨论
在本研究中，我们研究了PDE对子代大鼠肾足细胞发育和肾功能的影响，并探索了胎儿源性肾小球硬化可能的预防和干预靶点。具体而言，我们观察到PDE子代肾足细胞发育不良，从宫内持续到产后生活，可能导致了肾小球硬化。miR-135a-5p的表观遗传改变和表达可能参与介导PDE诱导的足细胞发育受损。并且生命早期对miR-135a-5p的干预部分逆转了PDE诱导的成年子代足细胞损伤和肾小球硬化表型。总之，这些发现揭示了PDE诱导胎儿源性肾小球硬化发展的先前未知的细胞和分子机制，并为重新审视当前孕期使用地塞米松的利弊提供了新的视角。同时，我们的研究为胎儿源性肾脏疾病的预防和治疗提供了有前景的miRNA策略。
足细胞是肾小球上皮细胞，在维持肾小球滤过功能中起关键作用。足细胞损伤或丢失导致肾小球硬化的发生和进展。在分化过程中，足细胞发育出规则间隔的足突，通过裂孔隔膜控制肾小球滤过。足细胞特异性标志基因Nephrin和Podocin对于维持足细胞的结构和功能完整性非常重要。在胚胎期，足细胞标志基因的缺失是足细胞发育异常的标志。在成年期，它们的表达降低导致足细胞结构和滤过功能破坏。由于足细胞是终末分化细胞，公认的观点是足细胞的最终数量在肾脏发育结束时确定。了解生命早期足细胞发育异常对肾脏疾病发病机制的影响，对于开发治疗胎儿源性肾脏疾病的新药干预可能非常重要。KLF4是Nephrin和Podocin上游的关键转录因子，据报道可促进足细胞分化，并且是维持足细胞稳定性所必需的。在蛋白尿动物和人类中，KLF4表达降低导致蛋白尿。发现足细胞特异性KLF4 KO小鼠中阿霉素诱导的蛋白尿显著加剧。此外，通过尾静脉注射或足细胞特异性转基因在患病肾小球中恢复KLF4表达可诱导足细胞标志物Nephrin的恢复，同时伴随白蛋白尿的减少。我们之前的研究发现，孕期咖啡因暴露导致子代大鼠肾脏KLF4表达降低，并可能与成年子代肾小球硬化的发生有关。这表明生命早期KLF4表达异常及其对足细胞分化的影响可能在胎儿源性肾脏疾病的进展中起重要作用。在本研究中，我们发现PDE子代胎儿和成年肾脏中足细胞标志基因和KLF4的表达降低，并伴有足细胞超微结构异常。这表明PDE可导致足细胞发育毒性。同时，与之前动物研究的结果一致，我们观察到成年PDE子代出现肾小球硬化。足细胞数量减少被认为是局灶节段性肾小球硬化（FSGS）的始动因素之一，因此我们假设足细胞发育毒性可能参与介导PDE诱导的胎儿源性肾小球硬化。此外，在MMSCs向足细胞分化的体外模型中，地塞米松降低了KLF4和Nephrin的表达，而过表达KLF4逆转了地塞米松对Nephrin表达的抑制。我们的研究证明KLF4在PDE诱导的足细胞发育毒性中起关键作用。
近年来的研究表明，由于miRNAs广泛参与各种疾病的发生和发展，它们已成为各种疾病的新兴治疗靶点。据报道，miRNAs表达异常会影响胎儿肾脏发育和肾脏的生理功能，并在足细胞疾病中发挥重要的病理作用。然后我们试图找出在PDE诱导的足细胞发育毒性中起关键作用的miRNAs，以期开发有前景的miRNA疗法。正如预测和文献证实，miR-135a-5p是KLF4的已识别的上游调节因子。在本研究中，地塞米松显著升高了肾脏组织和MMSCs中miR-135a-5p的表达。同时，对细胞和动物施用miR-135a-5p抑制剂治疗后，地塞米松对KLF4和Nephrin的抑制作用被逆转。这证明了miR-135a-5p高表达参与PDE抑制足细胞分化和发育。
考虑到miR-135a-5p的多效性，KLF4不太可能是其唯一与肾脏相关的靶点。先前的工作将miR-135a-5p通过TRPC1与足细胞损伤和糖尿病肾纤维化联系起来，并且miR-135a-5p已被证明通过靶向SIRT1促进肾脏细胞的纤维化程序，暗示除了miR-135a-5p/KLF4轴之外可能还存在额外的Ca2+处理和促纤维化分支。未来的工作使用无偏倚的、细胞类型解析的方法（例如，AGO2-RIP/CLIP结合转录组学/空间分析）将有助于绘制更广泛的miR-135a-5p调控网络及其在PDE中超出miR-135a-5p/KLF4轴的相互作用。
值得注意的是，PDE子代的外周血单个核细胞（PBMC）中miR-135a-5p增加，表明PDE相关的miR-135a-5p失调可能在可及的外周区室中可检测到。尽管在当前技术设置下无法可靠地定量血清/尿液中的miR-135a-5p，并且儿科采样需要前瞻性招募足够的样本量和随访，但这种临床验证对于确认miR-135a-5p作为胎儿起源靶点/生物标志物以及将机制发现转化为临床可操作的风险分层和干预所需的证据链至关重要。
性别是胎儿编程中的一个重要生物学变量，越来越多的证据表明产前糖皮质激素暴露可在多个器官系统中产生性别依赖的长期结果。在本研究中，我们将分析扩展到雌性子代，发现尽管足细胞标志物表达减少，但胎儿或成年雌性肾脏中的miR-135a-5p和KLF4没有显著改变，指出了PDE反应的性别二态性分子布线。这种差异与糖皮质激素信号传导可能具有性别二态性并可能涉及GR和性类固醇受体串扰的报道一致。值得注意的是，雌激素已被证明可拮抗糖皮质激素诱导的GILZ，增加了雌激素信号在女性中部分缓冲GR依赖性编程并限制miR-135a-5p/KLF4轴激活的可能性。总的来说，这些发现支持PDE的多器官、性别依赖的编程效应。PDE引起子代大鼠肾脏发育毒性的性别差异机制将在后续工作中进一步研究。
宫内编程是指不良宫内环境引起的胎儿基因表达或功能的改变，其影响可能持续到出生后甚至终生。研究表明，异常的表观遗传修饰是介导宫内编程改变的主要机制。我们的研究结果表明，PDE诱导子代肾脏miR-135a-5p高表达，从宫内持续到成年，表明可能存在miR-135a-5p高表达的宫内编程改变。进一步探索还发现，PDE组miR-135a-5p启动子区域H3K9ac水平从宫内到产后持续升高。体外实验表明，地塞米松直接改变了miR-135a-5p启动子区域的H3K9ac、H3K14ac和H3K27ac水平。这些结果表明miR-135a-5p启动子区域H3K9组蛋白的高乙酰化可能是导致PDE诱导子代足细胞发育毒性的宫内编程机制。
为了进一步探索miR-135a-5p宫内编程的分子机制，我们使用JASPAR网站预测GR可以结合到miR-135a-5p启动子区域，因此假设地塞米松可能作用于miR-135a-5p启动子区域GRE并募集各种辅助因子协同调控其表达。为确认GR与miR-135a-5p启动子区域的结合，我们利用双荧光素酶报告基因测定证实miR-135a-5p启动子区域确实存在GRE，并且其表达受地塞米松直接调控。
组蛋白乙酰化酶或去乙酰化酶通过组蛋白的翻译后修饰在表观遗传水平影响基因转录。P300是一种转录共激活因子，可以被多种转录因子（包括GR）募集并结合到靶基因的启动子区域，并通过组蛋白乙酰化修饰影响基因转录。据报道，组蛋白乙酰化酶P300可参与调节miR-135a-5p的表达。在探索PDE诱导子代miR-135a-5p宫内编程改变的分子机制时，我们发现地塞米松不仅促进了GR和P300的核内表达，还促进了GR和P300与miR-135a-5p启动子区域的结合。我们的结果表明，一方面，地塞米松激活GR进入肾脏MMSCs的细胞核直接促进miR-135a-5p转录，另一方面，它通过调节组蛋白乙酰化促进GR招募更多P300结合到miR-135a-5p启动子区域以促进miR-135a-5p转录。
尽管我们的数据支持组蛋白乙酰化是miR-135a-5p启动子处主要的持久调控层，但我们不能排除其他表观遗传机制——特别是DNA甲基化/羟甲基化——的贡献，这应在未来的工作中通过系统表观基因组分析来解决。此外，虽然我们的数据确定了miR-135a-5p启动子处的GR和P300，但偏向该复合物在PDE中增强占据的上游信号仍有待阐明。一个合理的层面是应激激酶对GR的控制，因为p38 MAPK/JNK信号可以通过位点特异性磷酸化调节GR功能（包括p38激活与GR Ser211磷酸化的联系，以及JNK相关的GR Ser226磷酸化与转录输出减少和核输出增强的联系）。并行地，PI3K–Akt信号可以增加P300共激活因子活性；Akt在Ser1834磷酸化P300已被证明可以增强其HAT功能和启动子募集，为我们观察到的组蛋白乙酰化升高提供了一条直接途径。最后，GR共激活因子组装通常由p160/SRC家族共激活因子支架，它们可以募集次级共激活因子如CBP/P300，这提供了PDE可能有利于GR–P300在选定基因座（如miR-135a-5p启动子）加载的额外机制。这些可能性可以通过在未来的研究中分析GR/P300磷酸化状态和关键上游激酶通路来检验。
胎儿源性疾病的早期预防和治疗由于病因和致病机制不明，缺乏干预靶点而面临重大挑战。近年来，靶向非编码RNA（ncRNAs），包括miRNAs和长链非编码RNA，已成为治疗各种疾病的有前景的策略。一个值得注意的例子是正在进行的用于治疗Alport综合征（一种与肾功能障碍相关的遗传性疾病）的抗miR-21的II期临床试验。这表明miRNAs作为预防和治疗肾脏疾病的靶点具有巨大潜力。然而，迄今为止只有少数miRNA疗法进入临床试验，尚无进入III期或获得FDA批准，其中一些因毒性而终止。鉴于这种情况，生物技术和制药行业专注于开发两类miRNA药物：miRNA模拟物和抑制剂（antagomir或anti-mir）。miRNA拮抗剂是一种经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂，通过体内与成熟miRNA强效竞争性结合，阻止
