《Journal of Hazardous Materials》：Early-Life Exposure to Polystyrene Nanoplastics at Ambient Doses Induces Neurotoxicity via mTOR-Mediated Autophagy-Lysosomal Dysfunction and Proteostasis Imbalance
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纳米塑料神经毒性机制及干预策略研究。通过未成熟小鼠模型证实环境剂量PS-NPs穿透血脑屏障引发行为异常，揭示mTOR信号通路异常激活导致自噬-溶酶体功能障碍，进而引发蛋白稳态失衡。证实4-PBA通过缓解内质网应激可逆转神经毒性，阐明自噬通路在纳米塑料神经毒性中的核心作用。
杨杰|彭阳|李京翰|杨水清|李敏|郑新月|陈新月|万健|朱志红|张玲|李瑞
公共卫生学院，湖北省职业危害识别与控制重点实验室，湖北省人文社会科学重点研究基地“健康湖北发展与社会进步研究中心”，武汉科技大学，武汉430065，中国
摘要
纳米塑料是一个新兴的全球环境问题，越来越多的证据表明它们具有神经毒性。最新研究发现，病原蛋白在神经系统中的异常聚集可能促进了纳米塑料引起的神经毒性，但调控这一病理级联反应的分子机制仍不清楚。在这里，我们使用未成熟的小鼠作为实验模型，代表那些更容易接触纳米塑料的婴儿和幼儿，以阐明早期生活中接触聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）所引起的神经毒性的分子机制。结果表明，与环境相关的剂量下的PS-NPs能够穿透未成熟小鼠的大脑并引发行为和情绪障碍。蛋白质组学分析确定mTOR信号通路是未成熟小鼠大脑对PS-NPs暴露的潜在反应通路。雷帕霉素干预和定量验证进一步证明，PS-NPs暴露会上调mTOR信号通路，从而导致溶酶体功能障碍和自噬通量的阻塞，进而破坏蛋白质稳态并最终引发神经毒性。此外，4-苯基丁酸（4-PBA）处理证实，蛋白质稳态失衡（表现为未折叠蛋白反应的激活）是这种神经毒性的直接驱动因素。值得注意的是，雷帕霉素和4-PBA处理均通过恢复蛋白质稳态来缓解PS-NPs暴露引起的神经毒性。总体而言，这些发现强调了由mTOR介导的自噬-溶酶体通路的失调是未成熟小鼠中PS-NPs诱导的神经毒性的核心机制，并提示溶酶体调节蛋白质稳态可能是对抗与纳米塑料相关的神经危害的潜在治疗策略。
引言
微塑料和纳米塑料（MNPs）被定义为小于5毫米（微塑料，MPs）和1微米（纳米塑料，NPs）的颗粒，是塑料降解产生的新兴环境污染物。MNPs广泛分布于水生、陆地和大气生态系统，并通过食物链不可避免地在人体内积累[1]。流行病学证据表明，MNPs暴露与不良健康结果相关，例如动脉粥样硬化患者的死亡风险增加（颈动脉斑块中含有MNPs[2]），以及炎症性肠病的严重程度与粪便中MNPs浓度升高有关[3]。值得注意的是，婴儿和儿童接触MNPs的程度远高于成人，这主要是由于他们经常接触塑料食品容器和玩具。定量评估估计，婴儿和儿童每天可能从塑料奶瓶中摄入约1.58×10?个MPs，这是成人平均每日摄入量的2.6×103倍[4]。不同年龄段人群粪便中MNPs浓度的比较分析进一步证实了这种暴露差异，突显了早期生活中接触MNPs的潜在风险[5]。此外，大多数毒理学研究使用的MNPs剂量不切实际地高，限制了它们对现实世界暴露情况的相关性[6]。相比之下，本研究关注与环境相关的剂量，以更好地评估NPs在早期生活中带来的健康危害。
尽管由于纳米尺度，NPs的检测在技术上具有挑战性，但新兴证据表明，它们的环境丰度可能超过MPs[7]。颗粒大小对NPs的生物利用度至关重要，NPs通过在其表面吸附生物大分子而产生“生态冠层”，从而增强生物相互作用[8]。最近的一项研究表明，痴呆症患者大脑中的MNPs水平显著高于健康个体[9]。值得注意的是，从人脑中分离出的大多数塑料颗粒小于200纳米[9]，动物模型实验也证实NPs在暴露后可以迅速转移到大脑中，强调了与NPs相关的神经风险可能更为严重[10]。此外，周等人发现NPs暴露会导致斑马鱼神经元丢失和轴突发育异常，最终导致行为障碍[11]。在小鼠中，观察到NPs通过吸入和口服途径在脑中积累，伴随行为障碍和认知功能障碍[12][13]。这些发现强烈表明NPs可能是神经毒性的一个风险因素。然而，大多数关于MNPs作为新兴污染物的现有研究主要集中在母体暴露的跨代效应上。因此，对发育中的大脑中MNPs的具体神经行为表现、剂量-反应特性及其潜在毒理学机制的系统理解仍然不足。
从机制上看，越来越多的证据表明蛋白质稳态失衡是NPs诱导毒性的关键因素。蛋白质稳态被定义为维持健康的蛋白质组，其失败是多种神经退行性疾病的标志[14]。值得注意的是，最近的蛋白质组学分析显示，NPs表面约62%的蛋白质成分参与蛋白质稳态的调节，表明NPs暴露可能会扰乱细胞内蛋白质的稳态[15]。计算建模表明NPs会促进蛋白质错误折叠和异常淀粉样蛋白沉积[16]，而实验数据进一步揭示聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）会加速Aβ寡聚体的形成，并在SH-SY5Y细胞中导致神经毒性[17]。此外，阴离子NPs被观察到可以与α-突触核蛋白结合，并加剧小鼠大脑中磷酸化α-突触核蛋白的病理积累[18]。总体而言，这些发现表明NPs暴露引起的蛋白质稳态破坏是神经毒性的关键病理机制。鉴于蛋白质稳态对细胞功能至关重要，细胞依赖于一个复杂的蛋白质质量控制系统，其中自噬是维持稳态的核心调节器[19]。越来越多的证据表明，NPs引起的毒性效应与自噬失调有关。例如，NPs暴露通过激活自噬和抑制滋养层细胞迁移、侵袭和迁移体形成来诱发流产[20]。另一项研究还发现，慢性NPs暴露通过抑制自噬来损害顶体生物发生[21]。然而，关于早期生活中接触MNPs如何以及通过何种机制将潜在的神经发育障碍与后期神经退行性改变联系起来的证据仍然很少。这一空白是理解早期环境暴露如何导致神经发育障碍和随后的神经退行性疾病的关键障碍。
为了填补这一知识空白，本研究建立了使用未成熟小鼠的早期暴露模型，以全面评估与环境相关浓度的PS-NPs的神经毒性效应。蛋白质组学分析确定mTOR信号通路是PS-NPs暴露的潜在响应通路，因此使用雷帕霉素来研究mTOR信号通路介导的自噬失调是否导致未成熟小鼠中与PS-NPs暴露相关的蛋白质稳态失衡。最后，使用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）来验证神经系统中的蛋白质稳态失衡是否直接驱动PS-NPs引起的神经毒性。总体而言，本研究阐明了未成熟小鼠中PS-NPs诱导的神经毒性所涉及的自噬-溶酶体通路（ALP）的调节机制，为风险评估和开发针对早期生活中NPs暴露引起的神经危害的干预策略提供了关键信息。
PS-NPs的特性
从Baseline（中国天津）购买了纯PS-NPs（60纳米）和红色荧光PS-NPs（60纳米）。通过拉曼光谱（LabRAM HR JY-Evolution）表征了PS-NPs的化学组成，通过动态光散射（DLS，Zetasizer Nano ZS90，Malvern，英国）测量了PS-NPs的流体动力学直径，并通过扫描电子显微镜（SEM，FEI QUANTA FEG250，美国）检查了PS-NPs的形态。
实验方案
本研究得到了华中师范大学伦理委员会的批准
PS-NPs的物理和化学特性
拉曼光谱在621.08、1001.14、1445.44和1602.07厘米?1处检测到PS-NPs的特征峰，与聚苯乙烯的标准光谱一致（图S1A）。SEM图像显示颗粒均匀分散（图S1B）。动态光散射（DLS）分析表明，大多数PS-NPs的流体动力学直径在40-80纳米范围内（图S1C）。
PS-NPs暴露在未成熟小鼠中引发行为障碍
未成熟小鼠暴露于荧光PS-NPs 24小时后，使用FITC-葡聚糖评估了血脑屏障（BBB）的通透性
讨论
早期生活中接触环境污染物对大脑发育构成重大风险[33]。新兴证据表明，MNPs可以穿透中枢神经系统（CNS），导致潜在的神经毒性效应。最近的研究在CNS疾病患者的脑脊液中发现了MNPs的存在，提供了MNPs进入神经系统的临床证据[34]。婴儿和幼儿是一个特别脆弱的群体
结论
本研究提供了实验证据，表明在环境剂量下接触PS-NPs会在未成熟小鼠中引发明显的神经毒性效应，表现为神经行为障碍、神经病理学病变和神经元生物标志物的失调。从机制上看，PS-NPs暴露会损害BBB的完整性，促进颗粒进入大脑，其中mTOR信号的异常激活会破坏ALP功能并导致蛋白质稳态失衡。持续的蛋白质压力进一步推动了这一过程
环境影响
由于婴儿和幼儿独特的饮食习惯和发展敏感性，纳米塑料对他们构成更高的风险。本研究表明，与环境相关的聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）剂量可以穿透发育中的大脑并在未成熟小鼠中引发行为异常。从机制上看，PS-NPs激活了mTOR信号通路并阻断了自噬通量，导致蛋白质稳态失衡和神经毒性。药理学干预
CRediT作者贡献声明
杨水清：资源、调查。
李敏：验证、资源。
郑新月：资源。
陈新月：资源。
万健：方法学。
朱志红：方法学。
张玲：监督、方法学。
李瑞：写作 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。
杨杰：写作 – 审稿与编辑、写作 – 原稿撰写、可视化、验证、资源、方法学、调查、数据管理。
彭阳：验证、资源，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（42077403）、湖北省农业农村厅（WHBZG-2024-158）以及中南民族大学自定研究资金（来自教育部的基础研究和运营经费CCNU18JCXK07和CCNU19TS066）、武汉科技大学“十四五”湖北省优势特色学科（团队）项目（2023C0101）的财政支持。
