AAV递送朊蛋白变体在基因敲除小鼠中快速建立朊病模型的新策略

《Brain Pathology》：Rapid generation of prion disease models using AAV-delivered PrP variants in knockout mice

本研究提出了一种利用腺相关病毒(AAV)载体在朊蛋白敲除(PrP-KO)小鼠中快速表达修饰朊蛋白(PrP)的创新方法。通过系统优化AAV构建体（含人突触素启动子、MVM增强子和WPRE调控元件），实现了神经元特异性表达，其表达水平达到甚至超过内源性PrP。该方法成功培育出能够传播经典RML和非典型GSS-A117V朊病毒株的模型，且二次传代实验证实了朊病毒株特性的完整保留。这一平台将模型构建时间从数月缩短至数周，为朊病毒结构功能研究、病毒株特性分析及治疗策略开发提供了强大工具。

　　

优化AAV载体实现中枢神经系统特异性高水平朊蛋白表达

为开发高效的大脑靶向朊蛋白(PrP)表达系统，研究团队系统评估了八种AAV9P31载体，这些载体包含不同的中枢神经系统(CNS)特异性启动子和调控元件。AAV9P31衣壳变体因其在C57BL/6小鼠中经全身给药后能有效穿过血脑屏障而被选用。所有构建体均包含一个修饰的小鼠PrP序列（W144Y突变），该突变使得BAR 224单克隆抗体能够特异性识别，从而与内源性PrP区分开来。

初步筛选评估了五种启动子（CaMKIIα、ratNSE0.3、CALM1、huSyn和gfaABC1D）与MVM内含子和WPRE调控元件的组合。通过静脉注射给PrP-KO小鼠后，第21天进行的全脑PrP表达分析显示，人突触素(huSyn)启动子 consistently 产生最高的转基因表达水平。为了优化调控元件的配置，研究人员构建了另外三种基于huSyn的构建体：不含增强子（仅huSyn）、仅含MVM内含子（huSyn-MVM）或仅含WPRE（huSyn-WPRE）。通过Western blot光密度定量比较分析显示，各组间的表达水平存在显著差异。包含huSyn启动子、MVM内含子和WPRE的完整配置（huSyn-MVM-WPRE）实现了稳健的PrP表达，其水平与内源性野生型表达水平相当（平均±标准差：野生型的93.3% ± 11.6%），并且显著优于所有其他测试的AAV配置。相比之下，缺少一个或两个调控元件的构建体表达水平显著降低。这种优化的构建体保持了高效AAV包装所需的小尺寸（总插入片段约2.7 kb）。

基于这些结果，研究团队将AAV-huSyn-MVM-mPrP-WPRE确定为主要构建体，用于后续的朊病毒传播研究。W144Y表位标签能够精确监测AAV来源的PrP表达，并有助于分析朊病毒转化。为了评估这种优化设计的通用性，研究人员还构建了表达银行田鼠I109 PrP（带W145Y突变）的等效构建体（AAV-huSyn-MVM-bvPrP-WPRE），为快速生成多种PrP变体表达系统提供了概念验证。

静脉注射优化AAV构建体可实现持续的全脑PrP表达，且达到生理相关水平

在通过系统性的启动子和增强子筛选确定最佳调控配置（huSyn-MVM-WPRE）后，接下来研究人员对最终确定的AAV构建体的空间分布和表达水平进行了表征。为了后续的朊病毒传播研究，他们构建了一个简化版本，仅包含W144Y表位标签（AAV-huSyn-mPrP W144Y），去除了筛选构建体中的其他标记物。

为了评估区域性的PrP表达模式，研究人员通过静脉注射将小鼠AAV-huSyn-mPrP W144Y构建体给予PrP-KO小鼠，剂量分别为1 × 10¹¹gc（n = 2）或5 × 10¹⁰gc（n = 1）。在给药后第21天，将大脑沿矢状面切开；一半脑用于免疫组化分析，对侧半脑则解剖成六个神经解剖学区域（嗅球、纹状体+间脑+中脑、皮层+海马、小脑、脑桥+延髓和脊髓）进行定量Western blot分析。

区域定量显示PrP表达在不同脑区存在差异，相对于野生型小鼠的内源性水平，其表达范围在0.65倍到2倍之间。较高剂量（1 × 10¹¹gc）在大多数区域 consistently 产生达到或超过野生型的表达水平，而较低剂量（5 × 10¹⁰gc）则产生更温和的表达。值得注意的是，尽管绝对表达水平存在定量差异，但所有三只动物均显示出成功的全脑转导，验证了AAV9P31递送系统的稳健性。

使用Bar 224抗体进行的免疫组化分析证实了生化观察到的区域表达模式，并揭示了AAV来源PrP的细胞定位。转导在整个神经轴上是明显的，梨状皮层白质中的表达尤为显著，这可能反映了从嗅球投射出的僧帽细胞轴突的强烈标记。在神经纤维网中观察到点状颗粒模式，神经元中偶尔可见胞浆内颗粒状染色，这与神经元过程和突触区室而非胶质细胞中的表达一致。小脑皮层显示出相对较低的信号强度，主要局限于颗粒细胞层的突触小球中。这种表达强度的区域差异可能反映了不同脑区AAV9P31转导效率、神经元密度和局部血脑屏障通透性的差异。

为了评估长期转基因稳定性，研究人员使用相同的载体设计进行了平行研究，表达mCherry（AAV-huSyn-mCherry），并在相同的调控元件下进行。三只小鼠接受静脉注射（2 × 10¹¹gc，100 μL），在270天（9个月）的观察期内保持明显健康。

总的来说，这些发现表明，优化的AAV-huSyn-mPrP W144Y构建体能够在PrP-KO小鼠中实现持续的全脑PrP表达，且达到生理相关水平。剂量依赖性的表达水平（从较低剂量的约0.65倍到较高剂量的约2倍，相对于野生型）为实验设计提供了灵活性。广泛的神经元转导、持续的长期表达和可调的剂量使该系统成为朊病毒传播研究的可行平台。

AAV介导的PrP表达敲除小鼠中经典和非典型朊病毒的快速体内传播

为了验证基于AAV的系统在真实朊病毒传播中的功能性，研究人员用两种结构不同的朊病毒株攻击表达AAV递送的PrP变体的PrP-KO小鼠：经典的小鼠适应RML株和非典型的人GSS-A117V株。这种双毒株方法能够评估该系统是否支持具有传统三条带糖型模式和非典型低分子量PrP^res特征的朊病毒的传播。

对于RML传播研究，四只PrP-KO小鼠接受AAV-huSyn-mPrP（带W144Y标签的小鼠PrP；5 × 10¹⁰gc，100 μL）的静脉注射。对于GSS传播，五只PrP-KO小鼠接受AAV-huSyn-bvPrP（带W145Y标签的银行田鼠I109 PrP；5 × 10¹⁰gc，100 μL）的静脉注射。在AAV给药后21天（允许转基因稳定表达），小鼠通过脑内接种1% RML感染的小鼠脑匀浆或1% GSS-A117V患者脑匀浆。

所有接受AAV给药的动物都出现了进行性神经系统症状，这些症状是朊病毒病的特征。表达小鼠PrP的RML攻击小鼠在接种后58、58、65和106天（dpi）发病（平均±标准误：72 ± 13 dpi，n = 4）。这些潜伏期明显短于接种相同RML毒株的野生型C57BL/6小鼠观察到的潜伏期（172 ± 4 dpi，n = 5），并且介于表达PrP水平约为内源性水平3-4倍的Tga20xPrP-KO小鼠（88 ± 1 dpi，n = 6）和过表达野生型小鼠PrP达内源性水平6-8倍的Tga20转基因小鼠（70 ± 3 dpi，n = 6）之间。终末期脑样本的定量Western blot分析证实，潜伏期较短的动物表现出相应较高的PrP表达水平。

表达银行田鼠I109 PrP的GSS攻击小鼠在105-112 dpi发病（平均：109 ± 1 dpi，n = 5），介于报道的接种相同GSS分离株的纯合子TgVole(I109)1×小鼠（67 ± 1 dpi）和杂合子TgVole(I109)0.5×小鼠（131 ± 7 dpi）的潜伏期之间。

通过Western blot检测终末期脑组织中的蛋白酶抗性PrP(PrP^res)，获得了朊病毒传播的生化确认。对于RML接种的小鼠，经过蛋白酶K消化和Sha-31抗体免疫检测后，脑匀浆显示出典型的PrP^res三条带糖型模式（约30、27和21 kDa），并具有特征性的RML毒株特征：单糖基化条带信号占主导。关键的是，使用Bar 224抗体（特异性识别W144Y表位）进行的平行检测证实，PrP^res完全来源于AAV递送的转基因PrP，而非任何残留的内源性蛋白，证明了修饰底物的真实转化。来自三只动物（58、106和65 dpi）的代表性Western blot图显示了在所观察到的潜伏期范围内成功的朊病毒传播。

对于GSS接种的小鼠，研究人员采用了一种针对非典型PrP^res（具有非经典生化特性）优化的特殊检测方案。经过连续的Pronase E消化、NaPTA沉淀和最终的蛋白酶K处理后，所有五个终末期脑样本都显示出7-10 kDa的低分子量PrP^res片段，这是GSS-A117V朊病毒的诊断性特征。这种非典型片段与经典的三条带模式形成鲜明对比，表明AAV系统支持结构不同的朊病毒构象体的传播。

AAV生成的朊病毒连续传代至野生型小鼠证实了RML毒株特性的真实保留

为了严格验证AAV介导的PrP表达支持产生具有保留的毒株特异性特征的真正可传播朊病毒，研究人员在常规野生型小鼠中进行了连续传代实验。这一关键对照旨在解决在AAV-PrP小鼠中传播的朊病毒在传播给表达生理水平内源性PrP的动物时，是否保持感染性和毒株保真度。

将来自一只在65 dpi时因RML感染而处于终末期的AAV-PrP小鼠的脑匀浆制备成1%（w/v），并通过脑内接种给五只野生型C57BL/6小鼠（7周龄）。所有接种的动物（5/5，100%发病率）都出现了进行性神经系统症状，这些症状是鼠朊病毒病的特征。疾病发生在接种后156 ± 3天（平均±标准误，范围：146-160 dpi），与通过C57BL/6小鼠传代的RML已确定的潜伏期一致，并且与第一代实验中使用的原始RML接种物相当（野生型对照中为172 ± 4 dpi）。

生化分析证实了所有五只第二代动物中存在蛋白酶K抗性PrP^res。Western blot显示了约30、27和21 kDa的典型三条带糖型模式，并具有特征性的RML毒株特征：单糖基化条带（中间条带）信号占主导。这种生化谱与原始RML接种物和第一代AAV-PrP小鼠的谱图无法区分，证明了通过连续传代，毒株特异性糖型比率得以忠实维持。

比较神经病理学检查提供了毒株保真度保留的决定性证据。对14个脑区的半定量病变分析显示，第二代AAV来源的RML小鼠和接种原始RML库存的参考对照小鼠之间的海绵状变化和PrP^res沉积模式几乎相同。两组都显示出特征性的RML病变分布，间脑结构（丘脑、下丘脑）受累显著，皮层和海马病理中度，小脑区域相对 spared。海绵状空泡化（实线）和PrP^res免疫标记强度（虚线）的半定量评分在所有检查的解剖区域显示重叠的分布，组间无统计学显著差异。

代表性脑切片的显微镜检查证实了定量发现。在枕叶皮层，第二代AAV来源的RML和参考RML对照都显示出无法区分的神经病理学特征。在低倍镜下，整个神经纤维网中可见广泛的细颗粒状PrP^res免疫反应性，呈特征性的突触模式。高倍镜视图显示了RML毒株典型的点状神经元周围和神经元内PrP^res沉积，伴有轻度至中度的海绵状变化。这些特征性特征（包括区域病变分布、PrP^res沉积模式和细胞定位）在从AAV-PrP小鼠到常规野生型宿主的连续传代中的保留，证明了毒株编码的神经病理学决定因素的忠实维持。