《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Water-soluble Cordyceps melanin: a photoprotector that enhances the survival of Beauveria bassiana and Metarhizium acridum conidia under UV-B radiation
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本研究针对昆虫病原真菌分生孢子田间应用时易受紫外线辐射失活的关键问题，开展了水溶性黑色素作为光保护剂的研究。研究人员通过超声处理从失活蛹虫草分生孢子中提取的黑色素，获得亲水性黑色素(HM)，发现0.1 mg/mL HM可显著提升球孢白僵菌和蝗虫绿僵菌分生孢子对UV-B辐射的耐受性（最高提升34.9%），且不影响其毒力和耐热性。该研究为开发环境友好型真菌杀虫剂提供了新策略。
在农业生产中，害虫防治始终是保障作物产量的关键环节。与传统化学农药相比，昆虫病原真菌作为生物防治剂具有环境友好、靶标特异性强等优势，其中球孢白僵菌(Beauveria bassiana)和蝗虫绿僵菌(Metarhizium acridum)是应用最广泛的两种昆虫病原真菌。然而，这些真菌的分生孢子（无性繁殖体）在田间应用时面临一个严峻挑战：紫外线辐射。太阳光中的UV-B辐射（280-315纳米）能够显著降低分生孢子的存活率，从而影响生物防治效果。
紫外线对分生孢子的伤害主要通过两种机制：直接引起DNA损伤（如形成环丁烷嘧啶二聚体）和诱导产生活性氧(ROS)导致氧化应激。尽管研究人员尝试了多种策略来提高分生孢子的紫外线耐受性，如添加油类载体或化学防晒剂，以及通过基因工程改造真菌使其自身合成黑色素等光保护物质，但这些方法各有局限性。油类载体可能改变制剂性质，化学防晒剂可能对环境产生负面影响，而基因工程方法则面临监管和公众接受度的问题。
黑色素是一种天然色素聚合物，具有卓越的紫外线吸收能力和抗氧化特性，在自然界中广泛存在于生物体内，起到光保护作用。然而，天然黑色素通常只溶于碱性溶液，这大大限制了其应用范围。因此，开发水溶性黑色素并将其应用于昆虫病原真菌制剂，成为解决这一问题的潜在途径。
在这项发表于《World Journal of Microbiology and Biotechnology》的研究中，研究人员探索了一种创新策略：从失活的蛹虫草(Cordyceps javanica)分生孢子中提取黑色素，并通过超声处理使其转化为水溶性形式，然后评估这种亲水性黑色素(HM)作为光保护剂在昆虫病原真菌分生孢子制剂中的应用效果。
为开展本研究，研究人员采用了几个关键技术方法：从墨西哥国家生物防治参考中心获取球孢白僵菌CHE-CNRCB 614、蝗虫绿僵菌CHE-CNRCB 213和蛹虫草CHE-CNRCB 307菌株；通过碱提酸沉法从失活蛹虫草分生孢子中提取黑色素，并利用超声处理获得亲水性黑色素(HM)；使用紫外-可见分光光度法分析黑色素和HM的光吸收特性；采用DPPH自由基清除实验评估抗氧化活性；通过测定不同HM浓度下的分生孢子存活率确定最佳工作浓度；评估HM对分生孢子耐热性和UV-B辐射耐受性的影响；最后通过生物测定验证HM对分生孢子毒力的影响。
确定黑色素和亲水性黑色素的特性
紫外-可见光谱
研究人员首先比较了黑色素和HM的紫外-可见吸收光谱。两者均在292纳米处显示最大吸收峰，这是黑色素的典型吸收特征。尽管经过超声处理，HM仍保持了黑色素的基本光吸收特性，表明其作为光保护剂的潜力。
抗氧化活性
通过DPPH自由基清除实验评估抗氧化活性发现，HM的抗氧化能力（IC50= 1706.80微克/毫升）比原始黑色素（IC50= 820.33微克/毫升）降低了约52%。这种下降可能是超声处理导致黑色素分子结构发生改变的结果，但HM仍保留了一定的抗氧化能力。
质量测试
确定最小抑制浓度
为了评估HM对分生孢子的相容性，研究人员测试了不同浓度HM对分生孢子存活率的影响。结果显示，0.1毫克/毫升的HM浓度对两种真菌的分生孢子存活率没有显著影响，因此选择该浓度进行后续实验。
耐热性
将分生孢子暴露于38°C不同时间后，评估其耐热性。结果表明，添加HM对分生孢子的耐热性没有显著影响。蝗虫绿僵菌比球孢白僵菌表现出更强的耐热性，在120分钟暴露后仍保持53.07%的存活率，而球孢白僵菌仅为19.5%。
UV-B抗性
这是本研究的核心发现。研究人员将分生孢子暴露于不同剂量的UV-B辐射（0、10、14和18千焦/平方米）。结果显示，添加HM显著提高了两种真菌分生孢子的紫外线耐受性。对于球孢白僵菌，在10、14和18千焦/平方米剂量下，添加HM的分生孢子存活率分别比未添加HM的高出34.9%、26.2%和23.3%。在最高剂量下，添加HM的分生孢子存活率是未添加HM的10倍以上。蝗虫绿僵菌也表现出类似趋势，在14和18千焦/平方米剂量下，添加HM的分生孢子存活率显著高于对照组。
生物测定
为了评估HM是否影响分生孢子的毒力，研究人员进行了生物测定实验。结果表明，添加HM不会显著改变分生孢子对黄粉虫(Tenebrio molitor)和紫翅斯蓬蝗(Sphenarium purpurascens)的毒力参数，包括初始死亡时间(t0)、特定死亡率(k)和最终存活率(S)。
研究结论和讨论部分强调了本研究的重要意义。首先，研究人员成功地从失活蛹虫草分生孢子中提取黑色素，并通过超声处理获得了水溶性HM，这为黑色素的应用开辟了新途径。HM保持了黑色素的紫外线吸收特性，尽管其抗氧化活性有所降低，但仍能有效保护分生孢子免受UV-B辐射的伤害。
最重要的是，研究发现0.1毫克/毫升的HM可以显著提高球孢白僵菌和蝗虫绿僵菌分生孢子的紫外线耐受性，而不影响其毒力和耐热性。这意味着HM可以作为一种兼容的光保护剂添加到昆虫病原真菌制剂中，提高其在田间应用的效力。
此外，使用失活分生孢子作为黑色素来源具有双重优势：既利用了生物废弃物，又为昆虫病原真菌制剂提供了一种高附加值的添加剂。这种方法避免了基因工程可能带来的监管问题，也比化学防晒剂更环境友好。
值得注意的是，HM的保护机制可能主要是物理性的，即通过吸收紫外线辐射来保护分生孢子，而不是通过抗氧化作用。这与HM抗氧化活性降低但仍能提供有效保护的现象一致。
这项研究为开发更有效的昆虫病原真菌制剂提供了新思路。未来研究可以探索不同HM浓度对防治效果的影响，优化提取和生产工艺以降低成本，以及评估HM对其他昆虫病原真菌的保护作用。此外，了解HM在分生孢子表面的具体分布和保护机制也将有助于进一步优化制剂配方。
总之，本研究开发了一种基于水溶性黑色素的新型光保护策略，有望显著提高昆虫病原真菌制剂的田间持久性和防治效果，推动生物防治技术的发展，减少对化学农药的依赖。
