《Bone Research》：Microenvironmental stiffness directs microtubule perturbation in chondrocyte mitosis via ILK-refilinB/Smad3 axis
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本研究揭示了软骨细胞感知胞外基质刚度并调控微管组装的力学信号转导新机制。研究人员发现，在骨关节炎相关的硬化微环境中，整合素连接激酶（ILK）被激活，进而上调refilin B表达，并通过p-Smad3信号通路促进微管形成，最终影响软骨细胞分裂行为。该发现为理解力学微环境调控软骨稳态的细胞生物学基础提供了新视角。
关节软骨作为无血管的结缔组织，在日常生活中承受着持续的机械负荷。健康的软骨需要通过软骨细胞精确感知微环境力学信号并调控细胞行为以维持组织稳态。然而在骨关节炎（Osteoarthritis, OA）进程中，软骨基质会发生显著硬化（从正常~34.86 kPa增至病变区~383.9 kPa），这种力学微环境的改变如何影响软骨细胞的生物学功能，特别是细胞骨架中的重要组分——微管系统的动态变化，仍是未解之谜。
发表于《Bone Research》的这项研究，通过构建不同刚度（软基质~46 kPa，硬基质~450 kPa）的聚二甲基硅氧烷（PDMS）培养基底，系统揭示了基质刚度通过ILK-refilinB/Smad3轴调控软骨细胞有丝分裂过程中微管组装的力学信号转导机制。研究发现，硬基质不仅能促进软骨细胞铺展和突触形成，还显著增强了微管的生成和有序排列。通过RNA测序和蛋白质组学分析，研究人员鉴定出refilin B（Rflnb）是调控微管组装的关键介质，其表达受基质刚度调控并通过p-Smad3信号通路发挥作用。进一步实验证实，整合素连接激酶（ILK）作为力学感受器，在refilin B介导的微管动态调控中扮演着不可或缺的角色。
研究采用单细胞RNA测序、免疫荧光染色、western blotting、siRNA干扰等技术手段，对人和小鼠原代软骨细胞进行分析。关键实验包括：通过扫描电镜观察细胞形态学变化；利用抑制剂（如nocodazole、blebbistatin、SIS3）干预特定通路；采用共聚焦激光扫描显微镜进行三维图像重建分析微管空间分布。
微管形成与力学刚度耦合
研究发现软骨细胞在硬基质上展现出更广泛的细胞铺展面积和更丰富的细胞突触。通过RNA测序显示，Tuba1a、Tuba1b、Tuba1c等微管蛋白亚型在硬基质上表达显著上调。免疫荧光显示α-和β-微管蛋白在硬基质组的软骨细胞中形成更清晰有序的束状结构，尤其在细胞膜边缘区域分布更为密集。
力学刚度介导有丝分裂软骨细胞中的微管分布
在静止期（G0）软骨细胞中，硬基质诱导更多微管束形成，并增强相邻细胞间的微管连接。在有丝分裂过程中，硬基质上的软骨细胞在分裂后期展示出更丰富的纺锤体微管，且连接两个子核的微管数量明显增加。细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin B2和CDK1在硬基质上的表达上调，表明刚度加速了软骨细胞周期进程。
Refilin B是软骨细胞响应力学刚度微管形成的关键介质
通过基因富集分析（GSEA）发现，TGF-β信号通路在刚度响应中显著激活。Refilin B被鉴定为刚度响应性表达的关键蛋白，其在硬基质上表达显著升高。抑制Smad3信号通路（使用SIS3抑制剂）可降低refilin B表达，并减少微管形成，证实了p-Smad3信号在refilin B介导的微管组装中的必要性。
ILK是refilin B介导的微管形成所必需的
研究发现ILK在硬基质上表达上调，且与整合素家族成员形成力学信号感受复合物。通过siRNA干扰敲低ILK表达后，refilin B和α-微管蛋白表达均下降，微管形成受损。实验证明ILK与p-Smad3信号存在相互调控关系，共同协调refilin B的表达和微管组装。
研究结论表明，软骨细胞通过ILK-refilinB/Smad3轴感知基质刚度变化并调控微管动态组装，这一机制在软骨细胞有丝分裂过程中发挥关键作用。在OA相关的硬化微环境中，该通路的异常激活可能导致软骨细胞分裂行为改变，进而影响软骨稳态。该研究不仅揭示了力学微环境调控细胞骨架的新机制，也为针对力学信号转导的OA治疗策略提供了潜在靶点。研究首次将refilin B确定为力学响应性微管调节因子，完善了从细胞外力学信号到细胞内微管重排的力学信号转导通路。
