摘要
本研究针对商业乳清渗透物粉末（Whey Permeate Powders, WPPs）开发了其水分关系，基于对三种商业WPPs的组成、结构组织和热性质的分析。研究提出了一个创新的双相结构模型，将WPPs颗粒形态分为两类：一类是由分散在连续非晶相（由乳糖和所有非乳糖成分组成）中的微小乳糖微晶构成的颗粒；另一类是由一个或少数几个大乳糖晶体构成，其表面覆盖一层薄而不连续的非晶层。WPPs的非晶相特征在于其玻璃化转变温度（Tg）极低，即使在很低的水分活度下也是如此，并且极易被水塑化。非晶相的比例及其物理性质在三种粉末间差异显著，并受组成和加工工艺的影响。本研究结果为深入理解WPPs的物理结构、水分关系和热性质奠定了基础。
1 引言
乳清渗透物是乳品工业的主要副产品，来源于干酪生产过程中乳清的超滤。尽管蛋白质含量相对较低，但乳清渗透物富含宝贵的矿物质和其他微量营养素，具有重要的营养价值。目前，大部分渗透物以液体形式用作饲料原料。粉末形式的乳清渗透物也被使用，但其稳定性和功能性方面存在重大问题，阻碍了高附加值产品的开发。
乳清渗透物的组成显著取决于其生产所用的乳清来源（酸性或甜乳清）以及加工工艺。除水外，乳糖是渗透物的主要成分，通常在干基中占75%至85%。渗透物进一步分为甜乳清渗透物和酸乳清渗透物，后者有机酸含量远高于前者。乳酸和柠檬酸是主要的有机酸，钾、钙、钠、镁和磷是渗透物中的主要矿物质。
作为重要的食品和饲料配料，渗透物常以粉末形式使用，其生产过程包括液体渗透物的浓缩、乳糖结晶、含乳糖晶体的浓缩浆料的喷雾干燥，以及最终干燥至水分含量约4%–5%。在WPP加工中，一旦乳糖结晶，浆料通常在约150°C下进行喷雾干燥。喷雾干燥后，粉末水分含量约为10%，这允许乳糖进行后结晶以最大化结晶乳糖的比例。最终干燥使用流化床将WPP进一步脱水至最终水分含量约5%。
许多研究者认为，乳糖结晶对于防止WPPs结块和粘性至关重要，因为乳糖晶体在相对湿度低于约85%时相对稳定。而无定形乳糖对水分高度敏感，导致乳清粉结块。大量研究集中于WPP加工中的乳糖结晶、晶体形成以及喷雾干燥的便利性。
尽管乳清渗透物粉末的商业化生产已很成熟，但观察到WPPs对运输和储存条件高度敏感。具体而言，WPPs的物理不稳定性导致结块和褐变问题。正如本文所论证的，尽管乳糖的结晶度在WPPs储存期间可能相对稳定，但大部分乳糖的结晶导致乳清渗透物的其他成分浓缩在一个非晶相中。由于这些其他成分通常是高极性和低分子量的，我们可以预期该非晶相对水分和温度敏感。因此，表征WPPs各相的物理状态对于预测其加工特性以及储存期间的稳定性至关重要。
分析无定形食品粉末结块和粘性的一个关键性质是玻璃化转变。升高储存温度会使无定形粉末从玻璃态转变为高弹态，伴随着分子流动性的急剧增加。在高弹态下，粉末颗粒的基质开始流动，导致颗粒结构塌陷和粉末结块。
结晶态的乳糖对温度和水的敏感性远低于无定形态。例如，在25°C时，α-乳糖一水合物的潮解点报告为99%，无水β-乳糖为87%。尽管结晶乳糖在加热时最终会熔化，但其熔化温度非常高（α-乳糖一水合物为200–220°C）。因此，结晶乳糖在长期储存期间相对稳定。
分析WPPs在常见储存条件下的物理稳定性时，需要考虑的主要水分关系是水分吸附等温线以及玻璃化转变温度对WPPs水分含量的依赖性。我们将采用的第三个水分关系是玻璃化转变温度对水分活度的依赖性。玻璃化转变是一种二级相变，当无定形材料的温度升高到其Tg以上时，它会从坚硬易碎的玻璃态转变为柔软的高弹态。塑化是指通过掺入低分子量化合物来降低基质Tg的过程。水因其极性和低分子量（18 Da）是无定形食品最有效的塑化剂。
鉴于WPPs的双相性质，需要基于一个包含结晶乳糖相和复杂组成的非晶相的结构模型来分析这三种水分关系（水分吸附等温线以及玻璃化转变温度对水分含量和水分活度的依赖性）。拟合其中两种水分关系的常用模型是用于水分吸附等温线的Brunauer–Emmett–Teller (BET)–Guggenheim–Anderson–de Boer (GAB)方程和用于玻璃化转变温度对水分含量依赖性的Gordon–Taylor (G&T)方程。我们将进一步证明，第三种水分关系，即玻璃化转变温度对水分活度的依赖性，可以从前两种关系中推导出来。
为了准确分析WPPs的水分关系，我们修改了GAB方程，以考虑锁定在WPPs结晶α-乳糖一水合物相中的水。我们将证明，在温度不太高的情况下，该结晶相中的水对外部水分活度的变化是惰性的。类似地，我们将基于锁定在乳糖一水合物晶体中的水分子不塑化WPPs非晶相这一认识，提出G&T方程的修改方案。因此，我们为GAB和G&T方程引入了乳糖一水合物晶体中锁定水含量的参数。
本研究的目的是确定WPPs的水分关系。基于对工业WPPs的分析，我们提出了一个将WPPs视为包含结晶相和非晶相的复合体系的新结构模型。接下来，分析了三种WPPs的水分吸附等温线以及玻璃化转变温度对水分含量和水分活度的依赖性。这是首次为WPPs建立这些所谓的水分关系。我们期望本文提出的WPPs结构模型将作为进一步研究以改善WPPs功能性和储存稳定性的关键基础。
2 材料与方法
2.1 渗透物样品与材料
购买了制药级的α-乳糖一水合物。从不同生产商处获得了三种商业WPPs，编码为WP A、WP B和WP C。乳清渗透物浓缩至60%至70%的总固形物，随后进行乳糖结晶。对于WP A和WP B，通过将浓缩物从~80–90°C冷却至~35–40°C（冷却速率5–6°C/分钟）诱导结晶，然后在最终温度下保持2–4小时以最大化乳糖结晶。WP C的工艺类似，但乳糖结晶条件不同：从~75°C的初始温度，以0.05–0.1°C/分钟的冷却速率冷却至~20°C，随后保持约12小时。结晶后，浆料进行喷雾干燥至水分含量约为10%，最后在流化床干燥器中进行最终干燥至最终水分含量约5%。通过将WPPs在60°C的去离子水中复溶至总固形物为30%，搅拌直至乳糖晶体完全溶解，然后使用实验室喷雾干燥器对分散液进行喷雾干燥，制备了WP A、WP B和WP C的完全无定形版本。
2.2 成分分析
使用Mojonnier方法测定渗透物粉末的脂肪含量。使用燃烧法（杜马斯法）测定总氮含量。使用三氯乙酸沉淀法测定非蛋白氮（NPN）含量。真蛋白氮通过从总氮中减去NPN计算得出。采用干灰化法测定灰分含量。使用高效液相色谱法（HPLC）分析WPP样品中的乳糖含量。
2.3 矿物质分析
通过电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定钾、钙、钠、镁和磷的含量。样品在ICP-OES分析前经过微波消解处理。
2.4 显微镜检查
使用配备偏光滤光片和数码相机的显微镜，通过直射光和偏光分析渗透物样品的形态和结构。测量并计算了样品中乳糖晶体的尺寸分布。
2.5 水分活度测定
使用水分活度仪在25°C ± 1°C下测定渗透物样品的水分活度。
2.6 水分含量测定和脱水动力学
通过在改良设置的实验室真空烘箱中减压干燥测定样品的水分含量（Qw）。渗透物样品在40°C、50°C、55°C、60°C、70°C、80°C和100°C下，在脱水空气流（流速2 L/min，减压~20 mbar）下干燥。通过样品在干燥过程中的重量损失重量法测定样品的水分含量。水分含量以湿基报告，但水分吸附等温线除外，其水分含量常规以干基报告。
2.7 水分活度平衡
通过将渗透物样品在含有已知水分活度（aw= 0.06 (LiBr); 0.11 (LiCl); 0.22 (CH3COOK); 0.33 (MgCl2); 0.43 (K2CO3); 0.54 (Mg(NO3)2)的饱和盐溶液的干燥器中，在T = 22°C ± 1°C下调节，使其在不同水分活度下达到平衡。通过重量法跟踪水的吸附，并根据平衡过程中的重量变化和样品的初始水分含量计算样品的平衡水分含量。
2.8 差示扫描量热法（DSC）
使用DSC仪测定样品的玻璃化转变（Tg）和与玻璃化转变相关的热容变化（ΔCp）。样品的起始玻璃化转变温度从第二次加热升温（5°C/分钟）时的热流曲线确定，取低温基线的切线与拐点处切线的交点。温度扫描范围从-60°C到+60°C。与玻璃化转变相关的热容ΔCp确定为高弹态和玻璃态之间的热容差。
2.9 X射线衍射（XRD）
使用X射线衍射仪测定WPPs（WP A、WP B、WP C）、在60°C和80°C下脱水的WP A、α-乳糖一水合物和β-无水乳糖的XRD衍射图。样品从2θ = 5°测量到40°。使用软件分析峰，并将角度范围转换为Cu-Kα辐射。通过积分测量样品的峰面积并减去无定形晕的积分，使用公式计算WPPs的结晶度。
2.10 统计分析与数据回归
使用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，置信水平为p < 0.05。使用Tukey多重比较检验比较平均值以评估样品间的显著差异。使用最小二乘法进行回归。对于非线性回归，计算每个观测值与模型预测值之间残差的平方，然后使用广义简约梯度算法（GRG）最小化所有残差的平方和。
3 结果与讨论
测定了三种源自干酪加工的商业WPPs的组成。WP B主要产自酸凝干酪，而WP A和WP C产自切达干酪的甜乳清；然而，所有三个样品均来自处理混合渗透物流的工厂。商业渗透物的乳糖含量在78.0%至81.5%之间。样品的脂肪含量较低，与先前文献一致。乳清渗透物通常含有2%–7%的蛋白质，且大部分是非蛋白氮。本研究中，三种乳清渗透物样品的NPN含量（以蛋白质当量计）在2.36%至3.61%之间，与文献结果吻合良好。WP B的灰分含量高于WP A和WP C。总体而言，我们的数值处于报告范围8%–20%的低端。我们乳清渗透物样品中最丰富的矿物质是钾，其次是钠和钙。
在直射光和交叉偏振光下获得了三种商业渗透物样品的显微镜图像。从图像中可以清楚地看到所有样品都含有结晶相。乳糖晶体的大小和形状在样品间差异显著。WP A、WP B和WP C的平均值分别为17.75、21.06和47.00 μm，并且WP A和WP B的粒径分布非常相似。WP C的特征是晶体尺寸远大于样品WP A和WP B，这还通过大的双折射区域和这些区域的规则形状得以见证，从而可以识别出α-乳糖一水合物特有的战斧形状。
从显微镜图像（包括偏光和直射光）中，我们观察到渗透物粉末颗粒具有复合结构，除了乳糖晶体外，还有非双折射的无定形相。对于WP A和WP B，这种无定形材料构成连续相，完全包裹着小的乳糖晶体。可能由于这种无定形相的延展性，WP A和WP B的颗粒明显呈圆形。在WP C的显微照片中，可以明显看到一些无定形材料，特别是在几个含有较小乳糖晶体的颗粒中，形成与WP A和WP B观察到的相似的颗粒。较大的乳糖晶体可能只有很少的无定形材料，但可能足以将几个晶体粘在一起（图中标记为“C”的颗粒）。对于WP C以及可能对于WP B，也可见混合形式的颗粒，其中一个较大的晶体从可能还包含几个完全嵌入的较小晶体的无定形相中突出（图中标记为“AC”的颗粒）。在WP A和WP B中观察到的较小乳糖晶体直接归因于结晶动力学：相对较高的冷却速率（5–6°C/分钟）和较短的保持时间（2–4小时）。这种快速冷却增加了形成的晶核数量，限制了后续的晶体生长。相反，WP C的生产条件类似于纯α-乳糖一水合物，采用较慢的冷却速率（0.05–0.1°C/分钟）和较长的保持时间（12小时）。这种较慢的速率产生较少的晶核，使得WP C中的结晶乳糖有足够的时间生长成α-乳糖一水合物经典的战斧形状。
为了解释渗透物粉末的结构-性质关系，我们提出了一个具有两种主要颗粒形态的WPPs双相模型（图2）。A型颗粒由连续的无定形相组成，该相嵌入多个小的乳糖晶体。第二种颗粒，C型，由一个或最多几个较大的乳糖晶体组成，表面覆盖一层浓缩的无定形相薄层，该无定形相由非结晶（无定形）乳糖、单糖、有机酸、肽和矿物质组成。如图1中WP B所观察到的，混合AC型颗粒很可能是由A型和C型颗粒团聚形成的。颗粒形态由结晶条件决定，较低的冷却速率以及较低的搅拌和表面刮擦水平会导致较大的晶体，如WP C。
为了开发渗透物粉末的水分关系，我们需要考虑各个结晶相和无定形相的材料特性。在环境温度下直至约85%的相对湿度，α-乳糖一水合物是热力学稳定的。在较高温度下，它可能会释放其结晶水。由于渗透物粉末含有相当数量的极性低分子量化合物，我们预期渗透物粉末的无定形相对水分高度敏感，并且很可能在室温下处于高弹态。本研究证实了这一点。因此，我们非正式地将无定形部分命名为“粘性相”，我们将其定义为处于无定形状态的WPPs的重量分数，其中包括存在于无定形相中的水。
提出的双相模型将WPPs的无定形相确定为控制粉末不稳定性的关键因素。该模型说明，由于进一步的乳糖结晶，无定形相的组成动态变化。这个过程将极性、低分子量的成分——特别是有机酸——浓缩到剩余的无定形相中，导致强烈的塑化，将Tg降低到典型储存温度（25°C）以下。WPPs中无定形相所产生的高弹态是储存和运输过程中结块和褐变的主要原因。成分分析显示乳酸含量显著（约7% 干基），按无定形部分的重量计算。鉴于乳酸是一种强塑化剂，我们假设它是WPPs无定形相中塑化的主要贡献者。因此，我们正在进行一项系统的模型研究，以研究乳酸对无定形乳糖的塑化作用。
在渗透物颗粒中，水存在于结晶相和无定形相中。无定形相中的水是可移动的，水蒸气压或水分活度控制着食品基质能够动态保持的水量。另一方面，位于结晶乳糖相中的水被限制在晶格中，在室温下不显示横向迁移率。只要相对湿度低于潮解点，结晶水不受（外部）水蒸气压的影响。因此，需要活化能来打破水在晶格结构内的相互作用。
因此，我们预期WPP无定形相中的水会响应环境湿度的变化，而α-乳糖一水合物相中的水将保持锁定在晶格中，前提是温度不太高。渗透物粉末中水的这种相依赖性行为可用于通过在不同温度下干燥粉末来确定无定形相的水分含量以及粉末的总水分含量。
我们首先研究了α-乳糖一水合物中水的释放（图4a）。在低温（T < 60°C）下，只有一小部分、几乎恒定的水从样品中释放出来（<0.7% 湿基）；对于40°C至60°C之间的任何温度，未观察到统计学显著差异（p < 0.05）。结果还表明，尽管脱水动力学取决于颗粒大小，但对于较长的干燥时间，提取的水量收敛到相同的值（图3）。我们进一步推断，在60°C及以下的温度下释放的少量水与表面水的释放有关。随着温度升高到60°C以上，释放的水量迅速增加，在100°C干燥60小时后达到5.8% ± 0.12% 湿基（图4a）。当校正表面水量（~0.5%–0.7% 湿基）后，100°C干燥温度下的重量损失接近α-乳糖一水合物的水含量（5% 湿基）。我们得出结论，在100°C时，α-乳糖一水合物中的所有结晶水都被释放，但在60°C及以下的干燥温度下仍被锁定。α-乳糖一水合物中水释放的温度依赖性可用于确定复合渗透物粉末无定形相的水分含量：通过在60°C下干燥，可以选择性地从渗透物粉末的无定形相中去除水，同时保留结晶水锁定在α-乳糖一水合物中，并允许提取表面水（图4b）。从图4b中，我们确定在60°C下干燥30小时可实现从无定形相中完全提取水，因为对于更长的干燥时间未观察到统计学显著差异（p < 0.05）。然后通过在100°C下干燥30小时测定WPPs中的总水量，并通过差值确定α-乳糖一水合物相中的水量（表2）。
对三种WPPs以及在几个温度下脱水的WP A进行了XRD分析，以评估脱水过程中晶体组织的潜在转变（图4c）。为了解释乳糖多晶型物，还对α-乳糖一水合物和β-无水乳糖进行了XRD分析。图4c可以确定干燥WPPs中晶体多晶型物的温度依赖性转变：在60°C的干燥温度下，WP A的衍射图证实该样品中的结晶乳糖仍保持α-一水合物多晶型，而在80°C的干燥温度下，观察到混合结晶相，其中α-乳糖一水合物占主导贡献，α-无水乳糖贡献较小，其特征2θ值在18.7°和21.6°处，以及在29.5°、29.7°和30.4°处有小峰。相反，在任何WPPs中均未观察到β-无水乳糖。XRD实验因此证实，当WPPs在60°C下干燥60小时时，一水合物形式得以保留。
正如对含有无定形相的材料所预期的那样，三种渗透物粉末显示出玻璃化转变，表现为平滑的S形转变（图5a）。鉴于在aw= 0.23时玻璃化转变温度较低（介于10°C和20°C之间），无定形相在室温（25°C）下处于高弹态，这对乳清渗透物粉末的物理和化学稳定性具有重要影响。
热容变化先前已被用于确定基质的无定形含量，基于玻璃化转变时的热容变化ΔCp与无定形相的比例成正比的假设。发现ΔCp测定可提供一致的结果，并且通常与其他技术良好吻合，除非对于ΔCp非常小的样品。我们采用这种方法来确定渗透物粉末的无定形分数。为此，测定了原始WPPs（图5c）和通过复溶并喷雾干燥WP A、WP B和WP C制备的完全无定形渗透物粉末（图5c）的ΔCp值。然后计算乳清渗透物样品的无定形分数为原始WPP的ΔCp与相应完全无定形形式的ΔCp之比（图5d）。
为了确认ΔCp方法，还使用XRD测定了初始WP A、WP B和WP C样品的结晶度
