《LWT》：Grapefruit peel essential oil nanoemulsion: Formulation optimization, physicochemical characterization, environmental stability, and application in strawberry preservation
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本研究针对草莓易腐烂、化学防腐剂存在安全隐患的问题，开发了一种西柚皮精油纳米乳(GPEO-NE)。通过单因素实验和响应面法(RSM)优化配方，所得GPEO-NE粒径为38.20 nm，PDI为0.15，zeta电位为-60.88 mV，在4°C下稳定性良好。GPEO-NE显著增强了自由基清除能力(ABTS和DPPH法；p < 0.05)，并在体外抑制了白色念珠菌(C. albicans)和金黄色葡萄球菌(S. aureus)。将1.28 g/100 mL GPEO-NE应用于草莓，在25°C下储存8天后，腐烂率降低62.50%，失重率限制在31.46%，同时有效缓解了外观、pH和可滴定酸度的变化。该研究为开发天然、高效的草莓保鲜涂层提供了新策略。
鲜红欲滴的草莓是许多人喜爱的水果，但其娇嫩的质地和高水分含量使其在采后极易腐烂变质，保质期短暂。传统的贮藏方法依赖于控制环境温度、湿度和气体成分，而近几十年来，合成化学品及其衍生物被广泛用于抑制微生物生长以延长食品保鲜期。然而，这类化学药剂的大量使用引发了诸多担忧，包括微生物耐药性、环境污染以及对人体健康的潜在毒性。因此，开发有效且天然的草莓保鲜替代品迫在眉睫。越来越多的研究者开始探索植物来源的生物活性化合物作为合成防腐剂的安全替代品。其中，从各种植物中提取的香精油因其显著的抗氧化和抗菌特性，成为有前景的天然食品添加剂、调味剂和防腐剂候选者。西柚作为芸香科柑橘属植物，其果皮富含独特的生物活性化合物。西柚皮精油不仅具有独特的芳香特征，能为食品增添清新的柑橘风味，还具有抗氧化活性和广谱抗菌作用等健康促进益处。然而，GPEO固有的高挥发性和较差的水溶性限制了其在食品工业中的广泛应用，这些缺陷导致活性成分快速损失以及在含水食品体系中分散无效，显著削弱了其保鲜功效。
为了直接解决挥发性和不稳定性这些局限性，纳米乳封装技术为增强GPEO的物理稳定性和生物利用度提供了一个颇具吸引力的解决方案，从而拓展其在食品保鲜领域的潜力。纳米乳是一种基本的封装系统，由两种不混溶的相组成，通过具有亲水头和亲油尾的乳化剂稳定，其性质受亲水亲油平衡值调控。在此系统中，乳化剂吸附在油水界面，降低界面张力并抑制分散相中的颗粒聚集。尽管纳米乳具有动力学稳定性，但它们在热力学上是不稳定的，容易发生奥斯特瓦尔德熟化、絮凝、聚结和乳析/沉降等相分离机制。因此，要实现长期稳定性，需要对配方参数进行优化。近年来，响应面法已成为优化纳米乳配方和制备工艺的首选方法，克服了传统方法耗时耗材的局限。
本研究旨在开发一种优化的GPEO-NE涂层。研究人员假设，优化后的GPEO-NE将通过液滴尺寸、PDI、zeta电位、降低腐烂率和减少失重等指标来提升草莓的采后品质和保质期。研究首先通过单因素分析筛选配方，并利用响应面法进行优化。在最佳条件下制备的GPEO-NE表现出较小的平均液滴尺寸、较低的PDI和较高的负zeta电位，并在4°C下具有优异的稳定性。此外，GPEO-NE展现出增强的自由基清除能力以及对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的体外抑制效果。最后，研究人员将GPEO-NE应用于新鲜草莓，评估其在25°C下储存8天期间的保鲜效果，包括腐烂率、失重率、外观、pH值和可滴定酸度等指标的变化。
为开展本研究，作者主要应用了几项关键技术方法：1) 纳米乳制备与优化：采用超声均质法制备GPEO-NE，并通过单因素实验和响应面法中心复合设计系统优化了乳化剂/助乳化剂与GPEO的质量比、Span 80/Tween 20比例以及助乳化剂与乳化剂的比例等关键配方参数。2) 纳米乳表征：利用动态光散射技术测定优化后GPEO-NE的平均粒径、多分散指数和zeta电位，并通过透射电子显微镜观察其形貌。3) 稳定性、抗氧化及抗菌活性评估：考察了GPEO-NE在4°C和25°C下储存30天的物理稳定性；通过DPPH和ABTS自由基清除实验评价其抗氧化能力；采用微量肉汤稀释法测定GPEO-NE及其原料对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。4) 草莓保鲜应用实验：以市售新鲜草莓为样本，通过浸泡涂膜方式应用不同浓度的GPEO-NE，并在25°C、75%相对湿度下储存8天，定期监测草莓的感官外观、腐烂率、失重率、pH值及可滴定酸度变化。
3.1. GPEO-NE的初步制备
通过筛选亲水性Tween系列和亲油性Span系列乳化剂的组合，确定Span 80和Tween 20的组合制备的GPEO-NE呈现出透明状态、最小粒径和较低的PDI值，表明粒径分布稳定且均一。在助乳化剂评选中，甘油表现出最优性能，能产生粒径更小、PDI更低的纳米乳，这可能源于甘油改变界面曲率和降低奥斯特瓦尔德熟化速率的能力。单因素实验结果表明，助乳化剂与乳化剂的比例、Span 80/Tween 20的混合比例、乳化剂和助乳化剂与GPEO的质量比、超声功率等因素均对GPEO-NE的粒径和PDI有显著影响，而乳化温度在60-90°C范围内对粒径影响不显著，均质时间在4-20分钟内对粒径和PDI影响也较小。
3.2. 利用RSM优化GPEO-NE
基于初步筛选结果，采用中心复合设计对GPEO-NE制备中的三个关键工艺变量进行优化。建立的二次模型具有高度的预测准确性，方差分析表明模型显著且失拟项不显著。三个过程变量均对粒径有显著影响。响应面图和等高线图直观地展示了变量间的复杂相互作用。模型优化得到的最佳条件为：乳化剂/助乳化剂与GPEO的质量比为7.63，Span 80/Tween 20比例为0.40，助乳化剂与乳化剂的比例为2.95。在此条件下预测的液滴尺寸为37.83 nm，实验验证值为38.20 nm，证实了模型的有效性。
3.3. 优化后GPEO-NE的表征
优化后的GPEO-NE液滴直径在37.90至38.70 nm之间，PDI值在0.14至0.17之间，体积基准和强度基准的尺寸分布均证实其呈单分散性。zeta电位为较强的负值（-58.20至-65.77 mV），表明即使使用非离子表面活性剂也具有良好的静电稳定作用。宏观上，GPEO-NE呈均匀的乳白色乳光液体，并显示丁达尔散射现象。TEM分析显示GPEO-NE具有均匀的球形形态和狭窄的尺寸分布，与动态光散射测量结果一致。
3.4. 优化后GPEO-NE的储存稳定性
稳定性评估显示，GPEO-NE在4°C下储存30天，液滴尺寸变化极小，PDI值几乎恒定，体系稳定；而在25°C环境温度下储存5天后，粒径即开始显著增大，至30天时达到243.17 nm，且PDI波动明显，表明均匀性下降，出现了相分离趋势。这表明低温储存可显著延长GPEO-NE的保质期。
3.5. GPEO-NE的抗氧化活性
通过DPPH和ABTS自由基清除实验评估GPEO-NE的抗氧化能力。结果表明，GPEO-NE表现出浓度依赖性的抗氧化活性，且在较高浓度下清除效果显著增强。在0.50 g/100 mL浓度下，GPEO-NE的DPPH自由基清除率为40.33%，显著高于纯GPEO的19.00%。ABTS实验也显示GPEO-NE的清除活性显著优于纯GPEO，其IC50值分别为0.12 g/100 mL和0.24 g/100 mL。纳米乳化可能通过提高生物活性化合物的溶解度/分散性、改变与自由基的相互作用或防止降解等方式增强了GPEO的抗氧化功效。
3.6. GPEO-NE的体外抗菌能力
体外抗菌活性评估显示，白色念珠菌对GPEO及其纳米乳最为敏感。GPEO在0.85 g/100 mL浓度时可抑制白色念珠菌生长，1.28 g/100 mL浓度时具有杀菌作用。GPEO-NE对白色念珠菌的MBC与GPEO相同，但MIC略高，这可能与纳米乳的缓释特性或其难以穿透白色念珠菌疏水生物膜有关。GPEO和GPEO-NE对金黄色葡萄球菌也表现出抗菌活性，在1.28 g/100 mL浓度下观察到显著生长抑制，但在测试浓度范围内均未达到杀菌效果。
3.7. GPEO-NE在新鲜草莓保鲜中的应用
草莓保鲜应用实验表明，GPEO-NE涂层能良好地附着在草莓表面。储存期间，对照组和空白纳米乳处理组的草莓出现严重皱缩、萎蔫和霉菌污染，而经GPEO-NE涂层的草莓则基本保持了原有外观。GPEO-NE涂层显著抑制了草莓的腐烂，在0.85 g/100 mL和1.28 g/100 mL浓度下，草莓在8天储存期内未检测到腐烂。GPEO-NE涂层还能有效减少草莓的失重，其中1.28 g/100 mL GPEO-NE处理效果最佳，8天后失重率为31.46%。此外，GPEO-NE涂层延缓了草莓pH值的上升和可滴定酸度的下降，其中1.28 g/100 mL GPEO-NE处理组的pH值变化最小，可滴定酸度保留最高，这表明涂层通过抑制呼吸活动减缓了有机酸的消耗，延缓了衰老进程。
本研究成功开发并优化了西柚皮精油纳米乳用于草莓保鲜。通过响应面法优化获得了具有小粒径、窄分布、高负zeta电位和良好储存稳定性的GPEO-NE。该纳米乳显著增强了西柚皮精油的抗氧化和抗菌活性。将其应用于草莓保鲜，能有效降低腐烂率、减少失重、延缓品质劣变，从而延长草莓的货架期。研究结果表明，GPEO-NE作为一种安全、高效的天然保鲜涂层，在草莓采后保鲜方面具有广阔的应用前景。这项工作为开发植物源精油纳米乳用于高附加值易腐水果的保鲜提供了重要的实验依据和技术参考。未来的研究应侧重于评估纳米乳与食品基质的相互作用、感官影响以及在实际冷链或非冷链商业场景中的长期保鲜效果，以推动其产业化应用。该研究论文发表在《LWT - Food Science and Technology》期刊上。
