《Horticulture Advances》：Optimization of in vitro adventitious shoot regeneration and genetic transformation systems in blueberry (Vaccinium corymbosum) using a heterogeneous Ruby1 gene
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本研究针对蓝莓(Vaccinium corymbosum)遗传转化平台有限的问题，以'Legacy'品种为材料，成功建立了高效的不定芽再生体系和农杆菌介导的遗传转化方案。通过优化激素组合(TDZ/NAA诱导后ZT伸长)、外植体处理(创伤、背面向下、12天暗培养)和转化参数(OD600=0.8、1小时真空渗透、6天共培养)，最终获得6.5%的转化效率。转入CgRuby1基因的转基因植株叶片花青素含量显著提高，关键合成基因(VcCHS、VcFHT、VcDFR、VcANS、VcUFGT)显著上调，为蓝莓功能基因组研究和精准育种奠定了重要基础。
蓝莓作为高经济价值的小浆果，市场需求持续增长，但其育种进程却受限于复杂的遗传背景——高度杂合、多倍体特性以及漫长的育种周期。传统杂交育种方式不仅耗时费力，还可能导致栽培品种遗传多样性降低，增加其对生物和非生物胁迫的敏感性。尽管基因工程技术为作物精准改良提供了强大工具，但在蓝莓，尤其是商业主栽的四倍体高丛蓝莓(Vaccinium corymbosum)中，稳定高效的遗传转化体系仍然是一个技术瓶颈。过去的研究虽在优化转化参数方面取得了一些进展，但转化效率普遍较低，且不同实验室间的重复性差，限制了其在功能基因研究和育种实践中的广泛应用。因此，建立一个高效、稳定、可重复的蓝莓遗传转化平台，对于推动其分子育种进程至关重要。
本研究发表在《Horticulture Advances》上，旨在解决上述挑战。研究人员以广泛栽培的高丛蓝莓品种'Legacy'为实验材料，致力于优化其离体不定芽再生系统，并在此基础上建立一套高效的农杆菌介导的遗传转化体系。为了直观地验证转化成功与否并探索基因功能，研究团队选择了一个来自紫皮柚(Citrus grandis)的、调控花青素合成的关键转录因子基因CgRuby1作为报告基因之一，该基因的表达能够导致植物组织呈现肉眼可见的红色或紫色，为筛选转基因植株提供了便利的表型标记。
为开展研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：首先，建立了以组培苗幼嫩叶片为外植体的高效不定芽两步法再生体系（诱导与伸长阶段）；其次，系统优化了影响农杆菌介导转化效率的关键参数，包括菌液培养方式、浓度(OD600)、侵染时间、真空渗透处理及共培养时间；第三，利用携带Egfp（增强型绿色荧光蛋白）和CgRuby1基因的双报告载体进行转化，并通过Kanamycin（卡那霉素）抗性筛选、荧光观察和PCR（聚合酶链式反应）进行转基因植株的分子鉴定；最后，对获得的转基因植株进行了表型（花青素含量）和分子水平（花青素合成通路关键基因表达）的分析。研究所用蓝莓材料采集自国内果园。
效果激素组合对不定芽再生的影响
研究人员测试了不同细胞分裂素（ZT、6-BA、TDZ）与生长素NAA的组合。发现TDZ (2 mg/L) 与NAA (0.5 mg/L) 的组合(T2N)能高效诱导不定芽分化（再生率达72.1%），但芽体生长状态不佳。而ZT (3 mg/L) 培养基(Z3)虽再生率较低(22.2%)，但芽体健壮。因此，开发了两步法再生策略：先在T2N上诱导20天，再转至Z3培养基促进芽体伸长，成功获得了大量生长良好的再生芽。
不定芽再生条件的优化
研究系统评估了多个影响再生效率的因素。发现采用组培苗顶部的幼叶作为外植体再生率最高(25.3%)；适度的创伤处理（方法2）能显著提高再生率(34.2%)；将叶片背面与培养基接触时才能有效诱导不定芽再生（再生率33.3%），正面接触则完全无法再生；在再生初期进行12天的暗培养能获得最佳的再生效果(27.7%)。
卡那霉素浓度的筛选
在未添加Kanamycin的培养基中，不定芽再生率高达83.4%。当Kanamycin浓度升至7.5 mg/L时，再生率降至39.4%。浓度达到10 mg/L时，再生被完全抑制。因此，选择10 mg/L作为转化实验中的筛选浓度，能有效抑制非转基因细胞的生长，减少逃逸。
农杆菌介导转化条件的优化
研究对转化流程中的关键步骤进行了精细优化。发现使用液体培养基振荡培养的农杆菌其侵染效率(8.5%)显著高于固体培养(2.6%)。最佳菌液浓度(OD600)为0.8，侵染时间为1小时，此时再生率最高(6.3%-7.4%)。引入真空渗透处理可使再生率提升至7.2%。共培养时间以6天为佳，再生率达6.5%。
EGFP荧光观察和CgRuby1的PCR分析
在Kanamycin抗性芽中成功观察到EGFP绿色荧光信号，而野生型对照中无信号，初步表明外源基因的整合。通过优化后的转化体系，对200个叶盘进行转化，最终获得13株抗性植株。PCR检测证实这13株均整合了CgRuby1基因，转化效率为6.5%。同时，通过检测农杆菌特异性基因VirD2，排除了菌体污染的可能性，确认PCR阳性条带来源于整合到植物基因组中的转基因。
转基因植株花青素含量及相关基因表达的提高
表型分析显示，转基因植株叶片呈现紫红色，而野生型为绿色。叶片提取物的颜色和花青素含量测定均表明转基因植株中花青素积累显著增加。进一步的qRT-PCR（实时荧光定量PCR）分析发现，外源的CgRuby1基因以及蓝莓花青素生物合成通路上的五个关键基因——VcCHS（查尔酮合成酶）、VcFHT（黄烷酮-3-羟化酶）、VcDFR（二氢黄酮醇4-还原酶）、VcANS（花青素合成酶）和VcUFGT（UDP-葡萄糖:类黄酮3-氧-葡萄糖基转移酶）在转基因株系中的表达量均显著上调。这表明异源表达的CgRuby1转录因子成功激活了蓝莓内源的花青素合成途径。
研究结论与意义
本研究成功建立并优化了一套适用于高丛蓝莓'Legacy'品种的高效遗传转化系统。其成功的关键在于：1）建立了两步法的不定芽再生体系，兼顾了高诱导率和良好生长状态；2）系统优化了外植体类型、处理方式和培养条件；3）精细调控了农杆菌介导转化的多个关键参数，特别是引入了真空渗透这一物理辅助手段，有效提高了转化效率。最终获得的6.5%的转化效率相较于前人报道有所提升。
利用该体系，研究人员成功将柑橘来源的CgRuby1基因转入蓝莓，并证实其能够通过调控MBW（MYB-bHLH-WD40）复合体，有效激活蓝莓内源的花青素合成通路，导致叶片中花青素大量积累。这不仅为利用该基因进行作物品质改良提供了案例，也验证了所建立转化体系的有效性。CgRuby1基因作为可视化的报告基因，在本研究中也发挥了辅助优化转化流程的作用。
本研究建立的遗传转化体系稳定性好、可操作性强，为未来在蓝莓中开展基因功能验证（例如利用CRISPR/Cas9进行基因编辑）、重要性状（如抗逆性、果实品质、成熟期等）的分子育种提供了坚实的技术平台。尽管该体系仍有提升空间（如转化效率、潜在嵌合体问题等），但它无疑将加速蓝莓生物技术育种的进程，对推动蓝莓产业可持续发展具有重要意义。
