《Microbial Biotechnology》：Exploiting Paraphaeosphaeria minitans and Its Antifungal Metabolites as Bio-Fungicides for Eco-Friendly Management of Head Rot Disease in Cabbage
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本文推荐了一项关于利用微小副暗球孢菌（Paraphaeosphaeria minitans）TNAU-CM 1菌株及其代谢产物防控由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的甘蓝烂头病的研究。该研究通过形态学、分子鉴定、扫描电镜（SEM）、气相色谱-质谱（GC-MS）分析、分子对接和分子动力学（MD）模拟等多技术手段，揭示了该菌株通过寄生菌核、产生细胞壁降解酶（如几丁质酶、葡聚糖酶）和抗真菌代谢物（如亚油酸和邻苯二甲酸二丁酯）等多种机制抑制病原菌。田间试验表明，其孢子悬浮液（5 mL/L）可显著降低病害发生率，产量达41.37吨/公顷，与化学杀菌剂效果相当。本研究为开发靶向核盘菌毒力因子SsYCP1蛋白的绿色生物农药提供了理论依据和实践方案。
引言
甘蓝是全球重要的蔬菜作物，但其生产常受由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的烂头病威胁，该病原菌寄主范围广，可侵染400多种植物，并以菌核形式在土壤中长期存活。传统化学防治易导致抗药性和环境污染，因此开发基于微生物拮抗剂的绿色防控策略尤为重要。本研究从印度泰米尔纳德邦田间染病甘蓝植株的菌核中分离到21种重寄生真菌，其中微小副暗球孢菌（Paraphaeosphaeria minitans）菌株TNAU-CM 1表现出最强的拮抗活性（菌丝生长抑制率达78.51%），并通过多组学技术系统解析了其生防机制与田间应用潜力。
实验方法
病原菌与重寄生菌的分离鉴定
从发病田块采集核盘菌菌核，经表面消毒后置于50%马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上培养，分离获得重寄生真菌。通过形态学观察和内部转录间隔区（ITS）测序进行分子鉴定，并利用特异性引物Cm spp. 1F/1R确认TNAU-CM 1为P. minitans。
拮抗活性与酶活性分析
采用平板对峙法评估重寄生菌对核盘菌的抑制效果。通过Remazol Brilliant Blue（RBB）标记底物法测定TNAU-CM 1在不同碳源（木聚糖、几丁质、羧甲基纤维素等）培养下的内切几丁质酶、内切葡聚糖酶和内切木聚糖酶活性。
代谢物鉴定与分子模拟
通过气相色谱-质谱（GC-MS）分析双培养体系中TNAU-CM 1产生的挥发性代谢物。以酿酒酵母cupin蛋白1ZNP为模板，构建核盘菌毒力因子SsYCP1的同源模型，利用AutoDock Vina进行分子对接，筛选关键代谢物（如亚油酸、邻苯二甲酸二丁酯），并通过iMODS服务器进行分子动力学（MD）模拟验证结合稳定性。
生物制剂开发与田间评价
优化TNAU-CM 1的液体发酵培养基（比较麦芽酵母 broth、糖蜜酵母 broth等），测定菌丝生物量和孢子产量。在温室和田间（随机区组设计）中评估其孢子悬浮液（5 mL/L）与对照生防菌（棘孢木霉TRI 15、解淀粉芽孢杆菌Bbv 57）及化学杀菌剂（肟菌酯·戊唑醇）对烂头病的防效，并测定甘蓝叶片防御酶（过氧化物酶PO、多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL）活性。
结果与讨论
重寄生菌多样性及拮抗活性
从100个菌核中仅3个发现重寄生现象，表明自然条件下菌核被寄生概率较低。21株重寄生真菌中，TNAU-CM 1（P. minitans）抑制效果最佳（78.51%），其次为绿粘帚霉（TNAU-CR 02，73.70%）。扫描电镜（SEM）显示TNAU-CM 1可形成分生孢子器（2.22 × 1.83 mm）和椭圆形分生孢子（6.69–13.46 μm），通过菌丝缠绕、附着胞样结构穿透菌核，导致其皱缩变形。
酶与代谢物介导的抗真菌机制
在木聚糖为碳源时，TNAU-CM 1内切几丁质酶活性最高（0.85 OD）；几丁质诱导下内切葡聚糖酶活性达0.79 OD。GC-MS从互作区鉴定到24种代谢物，其中亚油酸（7.74%）、邻苯二甲酸二丁酯（6.28%）含量较高。分子对接表明二者与1ZNP蛋白结合能分别为-7.6 kcal/mol和-6.2 kcal/mol，优于对照杀菌剂肟菌酯（-6.3 kcal/mol）。分子动力学（MD）模拟显示，结合后蛋白残基A33–A36的均方根波动（RMSF）值显著降低，提示复合物稳定性增强。体外抑菌试验证实亚油酸在1000 ppm时抑菌率达90%。
生物制剂效能与田间防效
糖蜜酵母 broth最适合TNAU-CM 1扩繁，菌丝干重（16.41 g/L）和孢子量（13.21 × 108spores/mL）最高。田间试验中，TNAU-CM 1处理（5 mL/L，3次喷施）防效达67.72%，病害发生率降至13.99%，产量41.37吨/公顷，接近化学杀菌剂（43.51吨/公顷）。同时，该处理可诱导甘蓝叶片PO、PPO、PAL活性峰值（7天接菌后），表明其可能激活系统抗性。
结论
本研究综合解析了P. minitans TNAU-CM 1通过重寄生、产酶（几丁质酶、葡聚糖酶等）及代谢物（亚油酸、邻苯二甲酸酯类）等多途径抑制核盘菌的机制。分子模拟提示其代谢物可靶向致病蛋白SsYCP1，抑制菌丝生长。田间验证表明其防效与化学农药相当，且能诱导植物抗性，为甘蓝烂头病的绿色防控提供了可靠候选菌株。
