《Physics of Life Reviews》：Biophysical Approaches to Cancer Diagnostics: Collagen Biomarkers in Colorectal Cancer
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本综述系统阐述了胶原蛋白作为关键生物标志物在结直肠癌（CRC）诊断中的价值，重点介绍了多种先进光谱技术（如拉曼光谱、FTIR、SHG、质谱等）如何通过无标记方式检测肿瘤微环境中胶原的重塑（Remodeling），揭示了其与肿瘤发生、发展的密切关系。文章深入探讨了胶原重塑的分子机制及其对组织生物物理/力学特性的影响，并展望了这些技术结合机器学习在提高诊断准确性、实现术中实时检测和个性化医疗方面的巨大临床转化潜力。
2. 连接胶原重塑与组织生物物理和力学特性的分子机制
细胞外基质（ECM）中最丰富的结构蛋白——胶原蛋白，在维持组织结构、机械强度和细胞行为方面发挥着核心作用。胶原组成、表达和交联的改变可以重塑组织的生物物理和力学特性。例如，I型与III型胶原比例的增加会导致更粗、更坚硬的纤维形成，从而增强组织刚度，同时降低其顺应性和弹性。同样，基底膜相关胶原（如IV型）被纤维状胶原替代，会增加刚性并降低通透性。这些成分转变创造了各向异性的刚度模式并改变了ECM的孔隙率，最终影响扩散、机械完整性和应力分布。
胶原产量的增加，由转化生长因子-β（TGF-β）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和机械应力等信号刺激，导致组织进一步硬化。活化的成纤维细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）上调胶原基因（如COL1A1和COL3A1），导致过度的ECM沉积。同时，基质金属蛋白酶（MMPs）活性降低或其抑制剂（TIMPs）表达增加，破坏了胶原周转，促进了积累。这些分子变化被细胞通过整合素受体和盘状结构域受体（DDRs）感知，进而激活黏着斑激酶（FAK）、RhoA和YAP/TAZ信号通路。这一力学转导级联形成了一个正反馈回路，强化了胶原合成、交联酶活性和ECM硬化。
对ECM力学最重要的贡献者之一是胶原交联过程，它稳定了纤维网络。酶促交联主要由赖氨酰氧化酶（LOX）及其亚型（LOXL2-4）介导，涉及赖氨酸残基的氧化脱氨，在胶原分子之间形成共价的醛亚胺或吡啶啉键。在缺氧或富含TGF-β的条件下，LOX的上调增强了胶原交联，增加了纤维刚性并对蛋白水解的抵抗力增强。这导致了一个更不易变形、更脆的ECM，将更高的机械应力传递给周围的细胞。
总的来说，这些分子事件导致组织微环境的生物物理和力学改变。胶原密度、纤维排列和交联的增加提高了组织刚度，同时降低了弹性和粘弹性阻尼。更硬的ECM触发整合素簇集和YAP/TAZ的核转位，强化了纤维化和肿瘤进展的正向前馈循环。最终，胶原重塑将柔软、顺应的ECM转变为僵硬且张力增强的支架，改变了细胞迁移、增殖、血管生成和药物渗透，这些是纤维化和癌症中病理性组织重塑的标志。
3. 胶原在结直肠癌中的生物学作用
胶原是结直肠组织ECM的基本组成部分，在正常和癌变条件下对结肠黏膜的结构完整性和生化信号环境都起着至关重要的作用。在存在的各种胶原类型中，I型胶原是结直肠组织中最丰富的纤维状胶原，在CRC组织中显著增加，促进了支持肿瘤生长和侵袭的促结缔组织增生性间质反应。其他纤维状胶原，如III型和V型，也很普遍，其中III型胶原在CRC中通常呈中度至高度表达，强化了以致密胶原基质为特征的肿瘤间质。基底膜相关胶原如IV型在肿瘤进展过程中通常会减少，反映了基底膜的破坏并促进了癌细胞的侵袭。此外，诸如VI型、VII型、X型和XVIII型胶原已被确定为CRC间质中改变的胶原网络的一部分，各自可能以不同方式促进肿瘤进展。
ECM的重塑，特别是胶原网络，与结直肠癌的肿瘤发生和转移密切相关。广泛的胶原沉积和重组促进了一个更僵硬、纤维化的肿瘤微环境，增强了癌细胞的增殖、侵袭和转移。胶原交联、纤维排列和降解的变化创造了一个允许的环境，支持上皮-间质转化（EMT）、血管生成和免疫逃逸。例如，增加的I型胶原已被证明通过涉及整合素相互作用的通路抑制分化并促进癌症干细胞样表型，从而增强了肿瘤的侵袭性和转移。此外，在侵袭性肿瘤边缘积累的一种特殊的组织病理学胶原模式——瘢痕疙瘩样胶原，与较差的临床结果相关，包括更高的肿瘤出芽、淋巴血管侵袭和转移率。胶原的降解产物和改变的胶原相关信号也已成为肿瘤进展和预后的生物标志物，反映了与结直肠癌进展并行的动态ECM重塑。因此，胶原在结直肠癌中的生物学作用从提供结构支持到主动调节癌细胞和肿瘤微环境的行为，突出了其作为肿瘤进展的功能驱动因子和诊断预后生物标志物的重要性。
4. 胶原重塑作为CRC生物标志物
胶原重塑日益被认为是CRC中的一个动态生物标志物，反映了一系列与疾病进展和患者结局相关的蛋白质组和基因组改变。蛋白质组学分析表明，在结直肠肿瘤发生过程中，胶原类型（特别是I型）显著上调和结构修饰。定量质谱和液相色谱研究已证实，在CRC中，组织和循环中的I型胶原及其降解产物水平显著升高，与肿瘤分期紧密相关并促进早期转移。基因组分析还揭示，胶原相关基因（如COL1A1, COL3A1, COL4A3, COL4A6）以及参与胶原降解的基质金属蛋白酶（MMP2, MMP9）的表达上调，与肿瘤发生、转移和较差的生存结局密切相关。
各种定量和定性分析进一步强调了胶原作为生物标志物的效用。例如，酶联免疫吸附测定（ELISA）、靶向质谱和液体活检方法允许检测血清和尿液中的胶原肽片段和端肽。值得注意的是，尿液中的高度特异性羟基化胶原肽和血清中的I型胶原端肽（如C端端肽）已显示出强大的诊断和预后价值，能够以高灵敏度和特异性将CRC（包括肝转移患者）与非癌症对照区分开来。当与传统血清标志物如癌胚抗原（CEA）结合时，胶原衍生肽的测量显著提高了检测转移性CRC的灵敏度，并改善了患者风险分层。
重要的是，胶原重塑的定性和定量评估，如瘢痕疙瘩样胶原含量的测量和基于多光子成像的胶原特征，已与关键临床特征稳健相关。例如，SHG成像揭示了结肠黏膜中胶原纤维组织的改变，显示随着接近恶性肿瘤，胶原结构逐渐破坏。这种胶原重塑与淋巴结转移风险增加、更高肿瘤分期、更大肿瘤出芽以及较差预后（包括更高的术后复发率和降低的总生存期）相关。最近，基于图像的先进分析使得将胶原特征与病理组学和临床变量整合以生成列线图和预测工具成为可能，经过大型患者队列验证，可用于识别高风险个体和定制治疗策略。
此外，通过蛋白质组/基因组谱分析和新型生物标志物检测量化的胶原重塑，提供了CRC进展和转移的强大、微创反映，为个性化诊断、风险评估和疾病监测提供了重要前景。
5. 用于检测胶原改变的光谱技术
5.1. 拉曼光谱
拉曼光谱和表面增强拉曼光谱（SERS）因其在检测组织和生物体液中生化变化的卓越灵敏度和特异性，在CRC诊断中引起了显著关注，而胶原蛋白成为一个引人注目的生物标志物。拉曼光谱利用单色光的非弹性散射来揭示胶原固有的分子振动特征，从而能够无标记地可视化和量化CRC进展过程中发生的胶原重塑。研究表明，通过检测与肿瘤诱导的ECM重塑相关的胶原光谱带改变，它能够区分癌变结直肠组织与正常组织。SERS通过使用金属纳米结构显著放大拉曼信号，从而将复杂生物样品（如血浆或血清）中的检测灵敏度提高到痕量分子水平。这种放大在CRC的液体活检应用中至关重要，其中胶原光谱峰的减弱对应于由肿瘤金属蛋白酶活性驱动的胶原降解增加，这是CRC微环境变化的标志。
研究已证明，反映多肽主链、氨基酸侧链和碳水化合物部分的特定胶原振动标记显示出独特的拉曼光谱模式，可以灵敏地区分正常结肠组织、良性息肉和恶性癌。重要的是，胶原亚型产生独特的拉曼特征，不仅允许定量检测，还允许定性评估其结构和构象修饰，这些是CRC癌变的早期标志。补充这些分子见解，Sato等人使用微型手持式拉曼光谱仪在一项临床研究中，对20名患者的46个结直肠组织部位进行了研究，重点关注由蛋白质相关波段（包括胶原）主导的指纹光谱区域，实现了对癌变组织的稳健区分，准确率超过85%，突出了便携式、快速、无标记组织分析的临床潜力。
在生物学上，胶原不仅提供结构支架，还通过ECM硬化和信号通路主动调节CRC中的肿瘤行为，影响侵袭、转移和 therapy 抵抗。拉曼光谱捕捉胶原分子重塑的能力提供了一个无标记、灵敏的窗口来观察肿瘤微环境，通过提供分子水平的生化信息超越了传统的形态学诊断。这种光谱精度和计算分析的结合使胶原成为一个有前途的生物标志物平台。
5.2. 傅里叶变换红外光谱
FTIR光谱是一种强大的、无标记的分析技术，基于其独特的振动指纹来识别和量化分子成分。使用宽带红外光源和干涉仪，FTIR生成包含全光谱信息的干涉图，通过数学变换成显示特定波数下分子振动峰的吸收光谱。这些振动特征反映了由拉伸或弯曲运动引起的分子键变化，允许以最小制备量对固体、液体和生物组织进行灵敏、非破坏性表征。特别是在结直肠癌诊断中，FTIR揭示了分子水平的细微生化改变，提供了超越传统基于形态学方法的详细见解。在FTIR可以检测的众多分子中，胶原作为ECM的重要组成部分，是CRC的关键生物标志物。
在一项研究中，FTIR显微光谱被应用于六个结直肠组织切片，以探索肿瘤间质内的胶原重塑。他们的分析揭示了癌组织与正常组织之间的显著光谱差异，不仅突出了常见酰胺带的变化，还突出了更具体的胶原相关信号的变化，例如在1200-1350 cm-1范围内的酰胺III和CH2弯曲振动。这些光谱变化与肿瘤区域胶原纤维排列增加和刚度增加相对应，反映了促进癌症进展的重塑过程。通过应用先进的化学计量学技术如主成分分析（PCA）和线性判别分析（LDA），研究人员能够仅基于胶原光谱特征可靠地区分恶性组织与健康组织，将这些分子变化定位为高度有前景的诊断标志物。
扩展这些发现，其他研究已经证明，捕捉胶原改变的红外光谱不仅可以区分癌组织，还可以区分诸如结肠炎等炎症状况。另一项研究在88个内窥镜活检样本中，将FTIR数据与改进的k近邻分类器结合，实现了区分正常、发炎和恶性结肠组织的高精度，强调了胶原相关光谱特征在区分不同病理状态方面的效用。在更精细的层面上，培养的结肠细胞的FTIR分析显示，与健康细胞相比，癌细胞中胶原相关的光谱标记存在显著差异，说明了该技术检测肿瘤发生中早期和基本分子变化的能力。
然而，也存在一些挑战，例如提高FTIR对异质性组织的空间分辨率、标准化数据采集协议以及改进光谱分析以解析复杂的重叠信号。尽管存在这些障碍，仪器和机器学习的持续进步具有克服这些障碍的巨大潜力，为胶原基FTIR生物标志物成为CRC诊断中常规支柱铺平了道路。
5.3. 荧光光谱
胶原作为结直肠癌诊断的重要内在荧光生物标志物日益突出，利用其反映肿瘤微环境中动态变化的独特光学特性。自体荧光寿命成像研究显示，胶原固有荧光，特别是在双激发波长下，在正常、腺瘤和癌组织之间存在显著差异。这些荧光寿命差异主要源于恶性转化过程中胶原结构和组织的改变，受影响的胶原纤维显示出不同的自体荧光寿命，与ECM重塑和与CRC进展相关的生化组织变化相关。
无标记光学成像技术进一步增强了原位可视化胶原特性的能力。双光子激光扫描显微镜捕获 specifically 来自胶原纤维的SHG信号，允许对CRC微环境内的胶原纤维形态和组织进行空间分辨、非侵入性量化。定量分析揭示了与正常结肠相比，肿瘤组织中胶原纤维明显的紊乱和组织完整性丧失，右侧结肠癌尤其呈现混沌模式，有助于肿瘤异质性和亚型区分。超越诊断区分，通过多光子成像获得的胶原荧光指标在大型、前瞻性随访队列中具有预后意义。
在生物学水平上，胶原的荧光特性与CRC肿瘤特有的促结缔组织增生反应有着内在联系，其中活化的基质成纤维细胞产生致密、高度组织的胶原基质，主要包裹肿瘤巢。这种富含胶原的环境通过限制侵袭性细胞和塑造促肿瘤发生的ECM来调节肿瘤细胞行为。这种胶原基质的分子密度和超分子组织直接影响其自体荧光特征，有效地将光学生物标志物与功能性肿瘤微环境动力学耦合起来。
结合荧光光谱和近红外漫反射光谱，通过整合胶原分子特异性和更深层的组织结构对比，放大了诊断性能。这种多模式方法显著提高了离体区分癌组织与正常组织的灵敏度和特异性，并有望用于快速、非侵入性临床应用，包括术中切缘评估。临床上，治疗前活检样本的定量胶原荧光谱图可以预测直肠癌患者对新辅助放化疗的病理完全缓解。使用从多光子成像中提取的胶原纹理特征的机器学习模型能够实现快速、非破坏性的预后判断，有助于个性化治疗计划。
5.4. 基于质谱的蛋白质组学
基于质谱的转化蛋白质组学使胶原能够作为CRC诊断的生物标志物，通过精确识别和量化组织和生物体液中的胶原肽及其生化修饰。该原理依赖于将胶原酶解成肽段，然后根据其质荷比进行分析，从而区分胶原类型并检测特定的翻译后修饰，如羟基化。这些修饰和肽段丰度模式反映了肿瘤进展过程中ECM的生化重塑。
利用质谱，研究人员已发现结直肠肝转移组织中多种胶原α链的上调。这些发现通过免疫组织化学进一步验证，强调了胶原通过重塑ECM以支持肿瘤增殖和侵袭，在培育转移前微环境中的关键作用。重要的是，胶原衍生肽不仅可以在肿瘤组织中成功测量，还可以在非侵入性临床样本如尿液中测量，其中羟基化胶原肽已显示出比传统标志物如CEA更优的诊断灵敏度和特异性。
在单个肽段定量基础上，质谱成像方法提供了福尔马林固定、石蜡包埋CRC组织内胶原分布的空间分辨图，将胶原丰度和重塑与肿瘤侵袭性和患者预后联系起来。在276名患者的回顾性队列中，在MSI衍生的胶原特征上训练的机器学习模型在预测早期结肠癌转移风险方面达到了超过90%的准确率，突出了胶原分子谱在指导临床决策方面的前景。在更广泛的范围内，蛋白质组学研究揭示了不同CRC队列中胶原亚型及其生化修饰的广泛改变。
质谱促进的研究代表了结直肠癌诊断和预后判断的变革性进步。通过提供ECM重塑的详细分子见解，基于MS的胶原测定能够灵敏检测原发性和转移性CRC，通过尿液肽支持无创监测，并通过空间蛋白质组学促进精确肿瘤表征。当与临床变量和计算分析相结合时，这些分子和结构标志物有望增强早期检测，为个性化治疗策略提供信息，并最终改善CRC管理的患者结局。
5.5. 多光子和二次谐波产生光谱
多光子显微镜结合SHG光谱利用胶原独特的非线性光学特性，作为一种强大的、无标记的生物标志物用于CRC诊断。MPM使用多光子激发产生内在组织信号，包括来自细胞代谢物的双光子激发荧光和 specifically 来自非中心对称结构（如胶原纤维）的SHG。胶原的强SHG响应，特别是在约820 nm激发下在410-420 nm附近的尖锐发射峰，提供了关于ECM完整性和组织的高对比度结构信息，无需外源染料。
这种定量多光子分析超越了单纯的检测，捕获内在的双光子激发荧光以及SHG信号。一项对132个新鲜离体结直肠标本的两阶段研究证明，MPM能够区分结直肠病变类型，包括腺瘤、增生性息肉和腺癌，具有高灵敏度和特异性，有助于临床操作过程中的实时组织病理学分类。此外，基于MPM的光谱成像通过量化SHG与双光子激发荧光信号比，提供了肿瘤侵袭深度的关键见解，该比值在纤维化、富含胶原的间质中增加，这是侵袭性肿瘤的特征。该指标与形态学标记物（如胶原碎片化和血管变化）结合，与标准病理分期和新辅助 therapy 后的肿瘤消退分级密切一致。
将MPM胶原SHG光谱成像与基质辅助激光解吸/电离质谱成像进一步结合，通过将胶原纤维组织与空间蛋白质组异质性相关联，丰富了肿瘤微环境分析。这种多模式方法揭示了肿瘤亚型和解剖位置之间独特的分子和结构差异，将SHG检测到的ECM重塑与差异肽表达谱联系起来，从而为结直肠癌病理生理学提供了整体的、高分辨率的视角，对个性化诊断和治疗计划具有强大的转化意义。
5.6. 漫反射光谱
漫反射光谱是一种非侵入性光学技术，通过测量从组织反射的光强度来探测其生化
