将CIMS（化学信息学与分子光谱技术）整合到分析框架中，以深入表征食品中的三酰甘油

《Talanta》：Incorporating cIMS in an analytical framework for the in-depth characterization of food triacylglycerols

本研究将循环离子迁移谱（cIMS）结合液相色谱-质谱（LC-MS）用于食用油中甘油三酯异构体（TAG）的鉴定，开发了GC-MS、LC-MS和cIMS-MS联用的分析框架。通过比较离子碰撞截面（CCS）和质谱碎片比例，成功鉴定21种TAG异构体，其中11种仅通过cIMS-MS实现。实验证实cIMS可有效分离同位素和异构体，弥补LC-MS分辨率不足的缺陷，为复杂油脂体系的深度分析提供新方法。

　　

卡洛·罗伯托·德布鲁因（Carlo Roberto de Bruin）|沃特·J.C.德布鲁因（Wouter J.C. de Bruijn）|布拉姆·范德普特（Bram van de Put）|让-保罗·文肯（Jean-Paul Vincken）|玛丽·亨内贝尔（Marie Hennebelle）

荷兰瓦赫宁根大学（Wageningen University）农业技术与食品科学系（Department of Agrotechnology and Food Sciences）食品化学实验室（Laboratory of Food Chemistry）

摘要

食品油中三酰甘油（TAG）成分的表征具有挑战性，尤其是由于存在异构体。主要瓶颈在于液相色谱-质谱（LC-MS）中异构体TAG的分离不完全，导致混合碎片谱使得识别变得困难。本研究探讨了在LC-MS分析中加入环状离子迁移谱（cIMS）作为额外分离维度的潜力，以改善TAG异构体的表征。通过结合气相色谱-质谱（GC-MS）、LC-MS和cIMS-MS，建立了一个分析框架来实现TAG异构体的表征。使用TAG标准品评估了识别TAG异构体的最佳方法：仅从cIMS-MS分离异构体后获得的纯碎片谱中确定的碎片比率；碰撞截面（^cIMSCCS_N2）值；或两者的组合。从纯碎片谱中获得的碎片比率是识别异构体的最强方法，因为某些TAG异构体的^cIMSCCS_N2值非常接近，难以准确识别。最终，利用该框架，我们在葵花籽油和橄榄油中识别出了21种TAG异构体，其中11种在没有使用cIMS-MS的情况下无法识别。总体而言，这项研究展示了cIMS提供的额外分离维度的潜力及其与经典GC-MS和LC-MS分析的互补性。

引言

植物油在全球范围内被用作烹饪油或食品成分。从化学角度来看，油主要由三酰甘油（TAG）组成，它们由三个脂肪酸酯化到甘油骨架上。TAG的物理化学性质主要取决于其组成[1]。TAG在结构特征上有所不同，如不饱和度、酰基链长度以及脂肪酸在sn-1、sn-2和sn-3位置的分布[2]、[3]。这些结构特征影响了TAG的营养价值，例如消化率。研究表明，位于sn-2位置的棕榈酸（16:0）在体内吸收明显优于位于sn-1/3位置的棕榈酸，从而对脂肪的肠道吸收和钙的排泄产生了显著的健康益处[3]、[4]、[5]。此外，通过混合和酯交换等多种工艺可以修改油的TAG组成和物理化学性质，以拓宽其应用范围[6]。这可能导致油组成更加复杂，因为可能存在不同的TAG结构和异构体（例如sn位置、cis/trans构型、双键（DB）位置、酰基链长度和混合类型的异构体），使得油的表征更加具有挑战性。

油的TAG表征通常使用液相色谱-质谱（LC-MS）进行，而气相色谱（GC）与火焰离子化检测器（FID）或质谱（MS）结合则常用于确定脂肪酸组成[7]、[8]。在使用LC-MS时，可以根据特定片段使用不同类型的质谱碎片技术来识别TAG结构[9]。碰撞诱导解离（CID）是最常用的TAG碎片技术。大多数研究中使用铵加合物（NH₄⁺），因为它产生的MS²谱包含二酰甘油（DAG）、单酰甘油（MAG）和游离脂肪酸（FFA）片段[10]。不同TAG异构体形成的片段相似，但特定片段之间的比率可能有所不同。大多数研究关注sn位置异构体或DB位置异构体之间的比率差异，例如不同sn位置异构体的DAG片段[11]。研究表明，在分析LC中共洗脱峰的混合碎片谱时，sn位置异构体内的片段比率差异可用于它们的识别甚至相对定量[12]、[13]、[14]。然而，使用碎片比率仍存在一些限制。首先，据我们所知，cis/trans和混合类型异构体内的比率差异尚未得到研究。其次，如果一个LC峰中同时洗脱出两种以上的异构体，则无法使用碎片比率，因为混合碎片谱的解卷积过于复杂，无法获得可靠的纯MS²谱。这限制了可识别的异构体和同位素物种的数量，并对其识别和相对定量造成了不确定性[11]。对于使用LC-MS进行小分子的结构识别，Schymanski等人建立了一个置信度系统[15]。基于此，目前的识别仅能达到2级或3级。对于TAG异构体的分离，可以使用靶向LC-MS方法来提高分离效果。例如，使用具有特定保留机制的柱子，如手性柱、C30反相柱或银离子柱[11]、[14]、[16]、[17]、[18]。然而，这些方法仅适用于一种特定的异构体类型（例如sn位置异构体），因此LC-MS同时用于非靶向分离同位素物种和所有异构体类型的应用受到限制。因此，上述分析方法对于复杂混合物（如实际食品脂质样本中的TAG）的全面深入表征仍然不足。需要开发互补的技术和方法来分离异构体和同位素TAG。

离子迁移谱（IMS）与LC-MS结合时，可以增加一个额外的分离维度，从而改善TAG异构体和同位素物种的分离，除了对映体[19]、[20]、[21]。IMS基于离子在气相中的迁移率（K）进行分离，迁移率与离子的大小、电荷和形状有关。在线性离子迁移技术中，如漂移管IMS（DTIMS），分辨率受路径长度的限制。最近开发的一种IMS技术是循环IMS（cIMS），它基于循环几何结构中的行波IMS（TWIMS）原理。通过增加通过迁移池的次数，cIMS可以提高分辨率，从而延长路径长度[22]。此外，可以使用预阵列和后阵列存储来存储感兴趣的离子。预阵列存储还可以在重新注入时加速离子，从而进行重复离子收集、重新注入和喷射，通过对特定离子（前体或片段）进行IMSⁿ实验，设计出复杂异构体混合物的分离方法[23]、[24]。在我们之前的研究中，开发了一种cIMS-MS方法来分离所有类型的TAG异构体，其中钠加合物的效果最好，并建立了结构-漂移时间趋势，有助于区分TAG异构体[25]。然而，尚未探索将cIMS与LC-MS结合用于食品油中TAG的深入表征的潜力。

在IMS中分离后，可以通过测量离子的漂移时间来确定其碰撞截面（CCS）。CCS可以用作IMS分离化合物的识别参数[26]。但是，当使用DTIMS以外的IMS技术（如行波IMS（TWIMS）时，由于离子轨迹更复杂，需要校准。为了在TWIMS中进行校准，可以使用从DTIMS分析中获得的已确定CCS值的化合物[27]。在使用cIMS进行多通道分离时，CCS校准更加复杂，因为可能存在环绕效应和空间电荷效应（较大离子团的峰宽化和到达时间偏移[28]、[29]。这可能导致较大离子团的峰宽化和到达时间偏移，影响cIMS测量的实验CCS值的准确性（以氮气作为漂移气体），称为^cIMSCCS_N2[27]。最近，Xia等人（2024年）发现了cIMS确定CCS时的一种不准确性来源，并开发了一种有效的方法来大幅提高这种确定的准确性[30]。简而言之，当T波阵列的传输方向从在IMS池中发送离子切换到飞行时间（TOF）检测器时，离子的漂移速度会发生变化。因此，测量的到达时间不仅受离子迁移率的影响，还受离子在cIMS池中的位置影响。为了补偿这种效应，应使用多次分离时间来测量校准标准和样品的到达时间，以便在切换场时采样多个离子位置。然后可以从多次测量的到达时间计算出不受离子位置影响的扰动周期漂移时间。使用扰动周期漂移时间进行校准后，多次实验的^cIMSCCS_N2值与参考^DTIMSCCS_N2值之间的准确误差非常低，约为0.3 - 0.7%[30]。

这种方法提高了测量CCS值的重复性和准确性，有利于使用cIMS-MS识别TAG异构体。最近，Schymanski等人（2014年）的置信度系统中纳入了IMS和CCS值的使用，用于PFAS分析[15]、[31]。在本研究中，采用了这两篇论文中的识别置信度级别：确认的结构（级别1）、可能的结构（级别2）、暂定的候选结构（级别3）、明确的公式（级别4）和感兴趣的特征（级别5）。TAG异构体的CCS库可以是非常有价值的实验室间信息，但由于IMS分离能力有限和CCS值变化较大，这些库在文献中仍然缺乏。将提供CCS和分离异构体及同位素TAG的碎片比率的cIMS-MS与通过GC-MS确定的脂肪酸组成结合起来，可以成为复杂油中TAG二级识别的强大工具。

本研究的目的是探索将cIMS分析与LC-MS结合用于食品油中TAG表征的潜力。这是通过将我们之前开发的cIMS-MS方法整合到一个分析框架中实现的，该框架用于结合GC-MS和LC-cIMS-MS对植物油中的TAG进行深入表征。在三种常用油（橄榄油、特级初榨橄榄油和葵花籽油）上评估了这种方法的潜力。分析框架首先进行GC-MS分析以确定油的脂肪酸组成，包括异构体种类。随后进行LC-MS筛查分析以获得油的总体TAG组成。此外，为了将TAG异构体的识别从级别3提高到级别2，并探索构建库的潜力，使用了所有TAG异构体类型（44对异构体）的标准品来确定它们的^cIMSCCS_N2值（校正了场切换效应），并研究它们在CID下的碎片比率差异。最后，通过LC分离和随后的离线cIMS-MS分析，使用多种cIMS-MS分离策略对这些样品进行了全面表征。

材料

ULC-MS级溶剂（包括乙腈、异丙醇、甲醇、n-庚烷和水）从Biosolve（荷兰Valkenswaard）购买。碘化钠（>99%）和氯化锂（>99%）粉末从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买。甲酸铵（>99%）粉末从Honeywell（德国Seelze）购买。商业脂肪酸甲酯标准品（FAMES Mix 37，Supelco）从Merck（美国新泽西）购买。TAG标准品列表如下

结果与讨论

我们开发了一个四步分析框架，用于植物油的深入表征，包括样品制备、GC-MS分析、LC-MS筛查和LC离线cIMS-MS分析（图2）。通过GC-MS分析了油的完整脂肪酸组成。这些结果后来用于结合LC-MS和LC离线cIMS-MS分析的数据来帮助识别TAG结构（第3.2节TAG组成，第3.4节使用LC-MS和离线cIMS-MS分析识别油样中的TAG异构体）

结论

本研究探讨了在LC-MS分析中加入环状离子迁移谱（cIMS）作为额外分离维度以改善食品油中TAG异构体表征的潜力。使用GC-MS、LC-MS和LC离线cIMS-MS的组合，建立了一个分析框架，用于食品油的深入表征。应用于葵花籽油和橄榄油时，成功识别出了21种TAG异构体，其中11种在没有使用cIMS的情况下无法识别

CRediT作者贡献声明

沃特·J.C.德布鲁因（Wouter J.C. de Bruijn）：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、方法论、概念化。卡洛·罗伯托·德布鲁因（Carlo Roberto de Bruin）：撰写——初稿撰写、可视化、方法论、研究、数据分析、概念化。布拉姆·范德普特（Bram van de Put）：撰写——审稿与编辑、方法论、概念化。玛丽·亨内贝尔（Marie Hennebelle）：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、方法论、概念化。让-保罗·文肯（Jean-Paul Vincken）：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理

注释

作者声明没有竞争性财务利益。

资金资源

无资金资源。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢Edwin Bakx、Giovanni van Kralingen、Peter de Gijsel和Mark Sanders提供的技术支持。同时，感谢Khoa Nguyen在MATLAB数据处理方面的帮助，以及Jos Hageman在统计分析方面的帮助。所呈现的结果是使用WUR-Shared Research Facilities拥有的Waters Select系列环状离子迁移质谱仪获得的。