《Synthetic and Systems Biotechnology》：Metabolic engineering of endogenous MEP pathway for enhanced lycopene production in
Escherichia coli
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本研究针对微生物异源合成番茄红素过程中前体供应不足的关键问题，通过引入极端耐辐射球菌Deinococcus wulumuqiensis R12的番茄红素合成基因（crtE、crtB、crtI），结合代谢工程策略强化大肠杆菌内源MEP途径。研究发现丙酮酸钠显著促进番茄红素合成，qPCR分析揭示其对关键基因表达的特异性调控。通过筛选不同来源的dxs、dxr、idi和ispA基因进行组合优化，最终获得番茄红素产量达293.70 mg/L（112.49 mg/g DCW）的工程菌株，为类异戊二烯代谢物的高效合成提供了新思路。
番茄红素作为一种重要的类异戊二烯化合物，因其强大的抗氧化活性而在食品、化妆品和农业领域具有广泛应用价值。然而，天然微生物合成番茄红素存在产量低、前体供应不足等瓶颈，制约其工业化生产。代谢工程与合成生物学技术的结合为破解这一难题提供了新途径，其中大肠杆菌因其生长快速、遗传操作工具丰富而成为理想的异源合成底盘细胞。
发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》的这项研究，聚焦于通过强化内源MEP途径来提升大肠杆菌番茄红素产量。研究人员首先从极端耐辐射球菌Deinococcus wulumuqiensis R12中克隆得到番茄红素合成关键基因crtE、crtB和crtI，构建了能够合成番茄红素的工程菌株H0。发酵优化发现丙酮酸钠的添加显著促进了番茄红素积累和细胞生长，这一现象引起了研究团队的深入探究。
为阐明其作用机制，研究人员采用定量实时PCR（qPCR）技术分析了关键基因的表达变化。结果显示，丙酮酸钠处理上调了dxr、ispA、crtE、crtB和crtI基因的表达，同时下调了dxs和idi基因的表达。这一发现提示，通过外源基因引入和内源途径调控的协同作用，可能进一步优化番茄红素合成效率。
关键技术方法包括：构建多基因共表达质粒系统，采用两阶段发酵策略（37°C生长阶段和25°C诱导阶段），利用qPCR分析基因表达谱，以及通过组合表达筛选不同物种来源的MEP途径关键基因。
3.1. 构建异源番茄红素合成的底盘菌株
研究人员将来自D. wulumuqiensis R12的crtE、crtB和crtI基因依次整合到pETDuet-1质粒中，获得重组质粒pET-IEB，转化至大肠杆菌BL21(DE3)后得到工程菌株H0。该菌株在基础条件下可实现8.67 mg/L的番茄红素产量。
3.2. 应用两阶段发酵策略生产番茄红素
通过优化发酵条件，发现14小时生长阶段（37°C）后转入25°C诱导阶段，并添加6 g/L乳糖作为诱导剂，可使番茄红素产量提高至43.33 mg/L，较优化前提升3.9倍。温度调控有效解耦了菌体生长与产物合成过程。
3.3. 丙酮酸钠对基因表达水平的qPCR分析
丙酮酸钠（25 g/L）处理显著提高了番茄红素产量和细胞生物量。qPCR分析显示，crtB基因表达上调达153.3倍，而dxs和idi基因表达受到抑制，表明丙酮酸钠通过特异性调控代谢通路基因表达促进番茄红素合成。
3.4. 基于内源代谢途径的番茄红素合成调控
将番茄红素合成途径分为模块1（crtE、crtB、crtI）和模块2（MEP途径基因）进行调控。增加crtE和crtI基因拷贝数可提高番茄红素产量，而crtB过表达反而降低产量，表明各酶之间的表达平衡对代谢通量至关重要。
3.5. 基于内源MEP途径的番茄红素合成调控
分别过表达来自E. coli MG1655和D. wulumuqiensis R12的dxs、dxr、idi和ispA基因，发现E. coli来源的dxs和R12来源的idi组合效果最佳。工程菌株H21（含dxs-idi组合）的番茄红素产量达到293.70 mg/L，较初始菌株H0提高33.88倍。质粒稳定性实验表明，经过10代传代后，菌株仍保持80%以上的质粒稳定性和高产特性。
研究结论表明，通过丙酮酸钠的添加与内源MEP途径的精准调控，成功构建了高产番茄红素的大肠杆菌工程菌株。该研究不仅为异源类胡萝卜素合成提供了新的基因资源，而且建立了一个可用于类似复杂类异戊二烯代谢物合成的参考框架。通过代谢通路的模块化设计和关键节点的协同调控，为实现微生物高效合成高附加值天然产物提供了重要技术支撑和理论依据。
