代谢工程与适应性实验室进化协同提升解脂耶氏酵母角鲨烯产量

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Metabolic engineering and adaptive laboratory evolution enhance squalene production in Yarrowia lipolytica

本研究针对传统角鲨烯生产方法的局限性，通过整合代谢通路重构与适应性实验室进化（ALE），在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中系统优化角鲨烯生物合成。研究人员通过脂滴工程增强储存容量、酶融合策略提升ERG20-SQS催化效率、强化ScHMG1表达优化前体供应，并结合H2O2梯度驱动的ALE获得进化菌株SY8-H3，最终在2.4 L生物反应器中实现4.53 g/L的角鲨烯产量，为微生物法生产高值萜类化合物提供了新范式。

　　

角鲨烯作为一种具有免疫调节、抗氧化、抗炎和抗癌功能的多效性天然三萜化合物，在营养保健品、化妆品和制药领域展现出巨大的商业潜力。全球角鲨烯市场规模预计将从2024年的1.45亿美元增长至2033年的2.15亿美元，年复合增长率达4.4%。然而，传统的角鲨烯来源面临严峻挑战：从深海鲨鱼肝油中提取存在病原体污染风险，而植物来源（如橄榄油或棕榈油）则受限于季节性供应、高生产成本和复杂的纯化工艺。因此，开发经济、可持续的角鲨烯高效生产方法成为当务之急。

微生物发酵技术以其生产周期短、绿色环保和成本效益高等优势，成为解决这一问题的理想途径。在众多微生物宿主中，解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）因其被美国FDA认定为"一般认为安全"（GRAS） status、高代谢效率和广泛底物利用能力而备受关注。这种非常规产油酵母具有先天的高脂质积累能力，为疏水性角鲨烯提供了理想的储存环境。尽管已有研究通过代谢工程策略在解脂耶氏酵母中提高角鲨烯产量，但如何系统性优化生物合成通路并提升菌株性能仍是当前研究的重点难点。

在此背景下，湖南农业大学的研究团队在《Synthetic and Systems Biotechnology》上发表了最新研究成果，通过多维度的代谢工程策略与适应性实验室进化（ALE）相结合，系统提升了解脂耶氏酵母的角鲨烯生产能力。该研究以过表达酿酒酵母来源ScHMG1的工程菌YL-1为出发菌株，通过脂滴工程、甲羟戊酸（MVA）途径调控、酶融合技术和适应性进化等四步关键策略，最终在2.4 L生物反应器中实现了4.53 g/L的角鲨烯产量。

研究采用的主要技术方法包括：基因工程操作（过表达DGA1、LRO1、ERG10、ERG13、ERG20、SQS等关键基因）、酶融合策略（构建ERG20-SQS融合酶）、适应性实验室进化（H₂O₂梯度胁迫筛选）以及发酵优化（摇瓶发酵和2.4 L生物反应器分批补料发酵）。分析检测方法涵盖气相色谱法测定角鲨烯含量、尼罗红染色与激光共聚焦显微镜观察脂滴形态、脂质提取与定量分析等。

3.1. 脂滴工程增强解脂耶氏酵母角鲨烯合成

研究人员首先通过共过表达二酰基甘油酰基转移酶编码基因DGA1和磷脂二酰基甘油酰基转移酶编码基因LRO1，促进三酰甘油合成和脂滴增殖，以增强角鲨烯的细胞内储存能力。工程菌SY-1的角鲨烯产量达到509.76 mg/L，比对照菌株YL-1提高49.93%。同时，SY-1的脂质含量从24.3% DCW增加至29.2% DCW，生物量提高35.77%。尼罗红染色和激光共聚焦显微镜观察证实，SY-1菌株的脂滴密度和荧光强度显著增强，表明脂滴增殖与角鲨烯积累呈正相关。这一发现证实了增强脂滴生物发生是提高疏水性萜类化合物积累的有效策略。

3.2. 调控MVA途径促进角鲨烯合成

研究团队进一步评估了甲羟戊酸途径关键酶基因对角鲨烯合成的影响。在SY-1基础上分别过表达ERG10（乙酰辅酶A乙酰转移酶）、ERG13（羟甲基戊二酰辅酶A合酶）、ERG20（法尼基焦磷酸合酶）和SQS（角鲨烯合酶），构建工程菌SY-2至SY-5。结果显示，过表达ERG13、ERG20和SQS的菌株角鲨烯产量分别提高6.28%、11.63%和21.63%，而过表达ERG10的SY-2菌株产量略有下降，表明碳流可能转向了菌体生长而非萜类合成。这一结果突显了ERG20和SQS作为角鲨烯合成通路关键节点的工程价值。

3.3. ERG20-SQS融合酶对角鲨烯生物合成的影响

为提高催化效率，研究人员采用两种融合策略构建ERG20与SQS的融合酶：直接融合（SY-6）和通过柔性连接肽GGGGS融合（SY-7）。结果表明，带有连接肽的融合酶效果更佳，SY-7菌株角鲨烯产量达到675.50 mg/L，比SY-1提高32.43%。酶融合策略不仅增强了底物通道效应，还成功将乙酰辅酶A碳流从三酰甘油合成重新导向角鲨烯途径，体现了代谢通量重排的协同效应。

3.4. 增强ScHMG1表达提高角鲨烯合成能力

HMG1是MVA途径的关键限速酶。研究团队在SY-7基础上于Int C位点整合ScHMG1（酿酒酵母来源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶），构建工程菌SY-8。该菌株角鲨烯产量提升至741.54 mg/L，增幅达9.77%，证明增强ScHMG1表达可有效缓解辅因子竞争和代谢反馈抑制，促进角鲨烯生物合成。

3.5. 适应性实验室进化工程改善角鲨烯合成

基于角鲨烯的抗氧化特性，研究团队创新性地采用H₂O₂梯度驱动的适应性实验室进化策略。在100-600 mM H₂O₂浓度范围内进行12代迭代适应，获得进化菌株SY8-H1至SY8-H6。结果显示，300 mM H₂O₂胁迫下获得的SY8-H3菌株表现最佳，角鲨烯产量达801.34 mg/L，比SY-8提高7.5%。然而，当H₂O₂浓度超过300 mM时，菌株性能下降，表明氧化胁迫强度需与菌株抗氧化能力相匹配。

3.6. 工程菌SY8-H3在2.4 L生物反应器中的分批补料培养

最终，工程菌SY8-H3在2.4 L生物反应器中进行分批补料发酵验证。以葡萄糖为唯一碳源，初始浓度60 g/L，24小时后以2 g/L/h速率补料。发酵240小时后，菌体生物量OD₆₀₀达到82，角鲨烯产量达4.53 g/L，是摇瓶发酵水平的4.65倍，展示了该工程菌株在规模化生产中的潜力。

本研究通过系统性的代谢工程与适应性进化策略，成功构建了高效生产角鲨烯的解脂耶氏酵母工程菌。研究不仅证实了脂滴工程、酶融合技术和关键基因过表达的有效性，还开创性地将H₂O₂驱动的适应性进化应用于角鲨烯生物合成，为微生物法生产角鲨烯及相关萜类化合物提供了重要参考。尽管4.53 g/L的产量与采用更复杂全局工程策略的研究相比仍有提升空间，但本研究提出的组合策略为高效萜类生产提供了可行方案。未来通过多组学分析揭示高产机制，结合细胞器协同工程与发酵优化，有望进一步推动角鲨烯生产向工业化应用迈进。