组合代谢工程赋能恶臭假单胞菌实现高水平灵菌红素生产

《Synthetic and Systems Biotechnology》：High-level prodigiosin production in Pseudomonas putida enabled by combinatorial metabolic engineering

为解决天然灵菌红素产量低、生产菌株安全性差等问题，研究人员开展异源表达与代谢工程优化研究，通过启动子工程、人工丙二酰辅酶A途径整合、转座子诱变及发酵优化，在恶臭假单胞菌KT2440中实现灵菌红素产量达1161 mg/L，为天然产物高效生物制造提供新策略。

　　

灵菌红素（prodigiosin）是一种具有抗菌、抗癌、抗疟疾等多种生物活性的三吡咯红色素，在医药和工业生物技术中应用前景广阔。然而，其天然主要生产者粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）存在产量低、潜在致病性及代谢背景复杂等问题，限制了大规模生产。为此，研究人员转向开发更安全、高效的异源生产系统。

本研究从甘蓝根际分离到三株产灵菌红素的粘质沙雷氏菌，但其产量仅约1.7 mg/L。基因组分析显示三者均携带高度保守的灵菌红素生物合成基因簇（pig基因簇）。为实现高产，团队以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440为底盘，通过组合代谢工程策略逐步提升产量：首先将pig基因簇的天然启动子替换为组成型启动子P₄₆，使产量提升至512 mg/L；随后整合人工丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）合成途径（由bauA和mcrC基因构成），并在诱导条件下将产量进一步提高至601 mg/L；通过Tn5转座子诱变筛选到负调控基因PP_4187（编码二氢硫辛酰胺脱氢酶），其敲除株产量达587 mg/L；最终经发酵培养基优化，在摇瓶和小型发酵罐中分别实现665 mg/L和1161 mg/L的产量。该研究为天然产物的异源高效生产提供了可推广的平台策略。论文发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》。

关键技术方法

研究采用以下核心实验手段：1) 从粘质沙雷氏菌BoR121中克隆pig基因簇，通过λ-Red同源重组技术构建异源表达载体；2) 启动子工程筛选（如P₄₆、LvaR/P_lvaA等）优化基因表达；3) 人工丙二酰辅酶A途径整合以增强前体供应；4) Tn5转座子诱变文库筛选负调控靶点；5) CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除目标基因；6) 发酵工艺优化（碳氮源筛选、补料策略）及5 L搅拌式发酵罐规模化培养。

研究结果

3.1 灵菌红素生产菌株的鉴定

从甘蓝根际分离到三株粘质沙雷氏菌（BoR121、BoR4-1、BoR4-11），均能产生灵菌红素，但产量仅为1.6–1.7 mg/L。HPLC和LC-MS验证产物结构与标准品一致。

3.2 基因组分析揭示保守生物合成基因簇

基因组测序显示三株菌均含12个次级代谢物基因簇，其中pig基因簇（约21 kb）结构高度保守，包含14个关键基因（pigA–pigN），为异源表达提供基础。

3.3 基因簇工程提升产量

将pig基因簇导入恶臭假单胞菌KT2440后，产量与天然菌株相当。通过启动子工程发现P₄₆驱动时产量最高（512 mg/L），显著优于其他启动子（如P_trc仅2.6 mg/L）。

3.4 人工丙二酰辅酶A途径的整合

引入由bauA和mcrC构成的人工丙二酰辅酶A途径，当由rhamnose诱导型启动子控制时，产量提升至601 mg/L，而组成型表达反而抑制生产，表明前体供应需精确调控。

3.5 转座子诱变筛选高产突变体

通过Tn5转座子文库筛选发现PP_4187和PP_1780突变体能提升产量。CRISPR/Cas9验证表明PP_4187（二氢硫辛酰胺脱氢酶）敲除株产量显著提高，而PP_1780（甘露糖基转移酶）敲除无显著影响。

3.6 发酵条件优化

以PP_4187敲除株为对象，优化发现甘油为最佳碳源（25 g/L），磷酸铵为最佳氮源（8 g/L），产量达665 mg/L。前体（脯氨酸、2-辛烯醛）添加未显促进效果。5 L发酵罐补料培养最终产量达1161 mg/L。

结论与意义

本研究通过启动子工程、前体途径优化、宿主基因组编辑和发酵工艺升级，在恶臭假单胞菌KT2440中实现了灵菌红素的高效异源生产。产量提升的关键在于精准调控基因表达、平衡前体代谢流及消除宿主负调控因素。该策略突破了天然生产菌株的局限，为其他高价值天然产物的微生物制造提供了可借鉴的工程范式。未来需进一步解析靶基因突变对代谢网络的重编程机制，并拓展至更多次级代谢途径的优化。