来自APCs的外泌体通过p53/p21信号通路改善人类皮肤成纤维细胞的衰老

《Tissue and Cell》：Exosomes from APCs Ameliorate Human Skin Fibroblast Senescence via p53/p21 signaling pathway

衰老相关皮肤病理的再生治疗研究：年轻脂肪前体细胞外泌体通过调控p21/p53/SIRT1通路改善皮肤纤维母细胞氧化应激和衰老表型。

　　

张永超|王美水|王彪|王聪毅|秦远军

福建医科大学附属第一医院整形与美容外科研究所

摘要

外泌体已成为皮肤再生医学中的重要资源。然而，只有少数研究证明了源自前体细胞的外泌体的抗衰老效果。此外，开发新型有效的基于前体细胞的疗法对于治疗皮肤衰老至关重要。在本研究中，比较了来自年轻（18-25岁）和老年（60-67岁）捐赠者的人脂肪源性前体细胞（APCs）的活力和增殖能力。收集并表征了来自年轻（yAPC-Exos）和老年（oAPC-Exos）APCs的外泌体，并研究了它们对衰老的人类真皮成纤维细胞（HDFs）的影响及其潜在的分子机制。老年APCs的增殖能力显著降低。yAPC-Exos和oAPC-Exos均促进了HUVEC的迁移和管状形成，以及HDF的迁移。外泌体处理降低了衰老HDFs中的细胞内活性氧水平，并缓解了与衰老相关的表型。这些效应主要通过下调p21和p53以及上调SIRT1来实现。值得注意的是，yAPC-Exos表现出比oAPC-Exos更明显的抗衰老效果。综上所述，yAPC-Exos可能成为治疗与衰老相关的皮肤疾病和美容应用的有效策略。

引言

细胞衰老可由多种机制引起，包括细胞生长停滞、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增加、细胞周期停滞以及p21和p53等细胞周期抑制因子的水平升高（Gu等人，2020年；Shin等人，2019年；Di Micco等人，2021年）。随着时间的推移，衰老细胞会在各种组织中逐渐积累，导致与年龄相关的病理过程，尤其是在皮肤中。人类皮肤衰老是由于内在和外在过程的共同作用，导致活性氧（ROS）的积累（Gu等人，2020年；Papaccio等人，2022年；Zhang等人，2024年）。细胞内ROS的积累会引起氧化应激，从而损害DNA、蛋白质和脂质，进而对皮肤细胞微环境产生不利影响（Gu等人，2020年；Papaccio等人，2022年）。这一过程最终导致真皮纤维化、皮肤过早衰老和皱纹形成。因此，在体外研究中广泛使用亚致死剂量的H₂O₂来诱导人类真皮成纤维细胞（HDFs）的过早衰老（Lee等人，2022a；Lee等人，2022b）。

脂肪源性前体细胞（APCs）具有分化潜能，因此可作为前体细胞使用。与干细胞类似，前体细胞可以分化为特定类型的细胞（Tan等人，2022年）。尽管前体细胞具有明显优势，但其分裂能力有限。因此，与脂肪源性干细胞不同，APCs分化为成熟的脂肪细胞，这一特性大大降低了后续临床应用中的肿瘤发生风险。

作为一类细胞外囊泡，外泌体起源于内吞囊泡，直径大约在30到180纳米之间（Kalluri和LeBleu，2020年）。外泌体可以携带多种分子，包括核酸、氨基酸、代谢物和脂质。外泌体作为细胞间通讯的媒介，通过传递其内容物来影响各种细胞的生理功能。许多研究发现，外泌体参与了多种细胞过程，包括但不限于生存、增殖、发育、分化和肿瘤形成（Isaac等人，2021年；Zheng，2023年）。因此，外泌体与许多病理状况有关，如心血管疾病、免疫反应、肿瘤进展和与年龄相关的疾病（Gehrmann等人，2014年；Robbins和Morelli，2014年；Casta?o等人，2018年；Zhang等人，2017年；Yuan等人，2018年）。多项体外和临床前研究报道了外泌体的抗衰老特性。近年来，干细胞和前体细胞的抗衰老能力得到了广泛研究，有证据表明分泌因子是观察到的治疗益处的原因（Lee等人，2022b；Liu等人，2019年）。由脐带来源的干细胞分泌的外泌体可以有效修复心肌缺血-再灌注损伤、肝纤维化和急性肾损伤造成的损伤（Hsu等人，2014年；Han等人，2019年；Ullah等人，2020年）。然而，来自人APCs的外泌体（APC-Exos）在皮肤衰老中的调节作用仍不清楚。鉴于外泌体在治疗应用中的优势——包括高稳定性、低免疫原性、归巢能力和易于控制剂量和浓度——APC-Exos在抗衰老治疗中的机制和治疗潜力需要进一步研究。

因此，我们假设APC-Exos可能有助于缓解皮肤衰老。为了验证这一点，我们研究了APC-Exos是否能够被HDFs内化并促进HDFs和HUVEC的迁移，从而促进皮肤再生。我们还比较了APC-Exos的物理特性和生物功能。

实验部分

动物实验

为了研究皮肤衰老与脂肪组织衰老之间的关系，我们从Charles River Laboratories（中国北京）获得了6-8周大的雄性C57BL/6小鼠，并将其饲养在武汉同济医院动物中心，采用12小时光照/黑暗周期。小鼠分别在4个月（6个月大）、12个月（14个月大）和28个月（30个月大）时使用过量戊巴比妥钠进行安乐死。所有动物实验均获得了机构动物委员会的批准。

不同年龄小鼠皮肤和皮下脂肪的衰老

在人类中，皮下脂肪组织的衰老比皮肤衰老更早发生。在本研究中，我们研究了小鼠皮肤和皮下脂肪组织的衰老情况，发现皮下脂肪的比例随年龄增长而减少（图1A、B），而p53阳性细胞和皮肤纤维化的程度随年龄增长而增加（图1A-C）。

年轻和老年人类APCs的差异

APCs与脂肪SVF密切相关，具有增殖和分化为成熟脂肪细胞的能力。

讨论

细胞衰老已被证实与许多哺乳动物组织的衰老有关，尤其是皮肤。在本研究中，我们发现小鼠皮下脂肪组织的衰老比皮肤衰老更早发生。具体来说，皮下脂肪组织的厚度随年龄增长而减少。此外，来自老年捐赠者的APCs的活力和增殖能力低于来自年轻捐赠者的APCs。重要的是，yAPC-Exos对H₂O₂表现出更强的再生效果。

伦理批准

所有动物护理和实验程序均获得了华中科技大学同济医院动物护理和使用委员会的批准。研究方案也获得了同济医院伦理委员会的批准，所有受试者均根据《赫尔辛基宣言》的原则提供了事先的书面知情同意。

资助信息

本研究得到了福建医科大学科研启动基金（项目编号：2021QH1081）、广西壮族自治区自然科学基金（编号：2024JJB140115）、广西科技基地和人才专项基金（GUI KE AD23026206）以及福建省校企科技合作项目（项目编号：2022Y4012）的支持。

作者贡献

张永超设计并实施了实验。秦远军撰写了主要文本。王美水、王彪和王聪毅审核了数据。所有作者均审阅并批准了手稿。

CRediT作者贡献声明

张永超：撰写——初稿、资源获取、方法学、研究设计、资金申请、数据管理。王聪毅：监督。秦远军：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、方法学、资金申请。王美水：数据可视化、验证、监督、软件使用、资源管理。王彪：数据可视化、验证、监督、软件使用、资源管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢华中科技大学同济医学院同济医院生物医学研究中心提供的技术支持。

所有动物实验均获得了同济医学院动物研究委员会的批准，并严格遵循ARRIVE指南和《实验动物护理和使用指南》（美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）进行。

声明

作者声明他们没有