《Applied Microbiology and Biotechnology》：Arsenic efflux mechanisms in ectomycorrhizal mushrooms Hebeloma bulbiferum and Hebeloma sinapizans
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【编辑推荐】本研究针对有毒 metalloid 砷（As）的环境污染问题，聚焦于外生菌根蘑菇 Hebeloma bulbiferum 和 Hebeloma sinapizans 中砷解毒的关键转运蛋白ACR3。研究人员通过异源表达、荧光定位、基因表达分析等技术，证实HbACR3和HsACR3为定位于质膜的砷(III)外排泵，其表达受砷酸盐（As(V)）诱导，显著降低细胞内砷积累并增强砷耐受性。该工作为理解真菌在砷生物地球化学循环中的作用及真核生物砷解毒机制的进化提供了新见解。
砷，这个在元素周期表中占据第33位的类金属，因其强烈的毒性而臭名昭著。当自然过程（如风化）或人类活动（如采矿、冶炼、燃煤）将其从地层中释放出来时，它便成为生态系统中一个持久的威胁。在自然界中，砷主要以无机的砷酸盐（As(V)）和亚砷酸盐（As(III)）形式存在。As(V)因其与生命必需元素磷酸盐结构相似而干扰能量代谢，As(III)则能通过与蛋白质的巯基结合使多种酶失活。为了应对这种无处不在的毒物，从细菌到人类，几乎所有的生物体都演化出了相应的解毒途径。其中，最为核心的机制之一，便是将砷排出细胞。这个过程主要依赖于一类专门的膜转运蛋白，而ACR3家族便是其中在真菌、植物和部分细菌中广泛存在的重要成员。
尽管真菌，特别是大型真菌（蘑菇），在陆地生态系统的物质循环中扮演着关键角色，并且已知能够从土壤中吸收和积累砷，但人们对它们具体的砷解毒分子机制，尤其是砷外排转运蛋白的认识，仍然相当有限。值得注意的是，即使是亲缘关系很近、生长在相同环境中的蘑菇物种，其砷积累能力也可能存在巨大差异。例如，本研究关注的两种外生菌根蘑菇——Hebeloma bulbiferum和 Hebeloma sinapizans，虽然采集自同一地点，但前者子实体的砷含量约为后者的20倍。这种显著差异暗示了它们可能采用了不同的砷处理策略。为了揭示其背后的分子基础，研究人员将目光投向了ACR3砷转运蛋白。
研究人员首先从H. bulbiferum和 H. sinapizans中鉴定并克隆了各自的ACR3基因（分别命名为HbACR3和HsACR3）。生物信息学分析显示，它们编码的蛋白质均由399个氨基酸组成，序列相似性高达99%，并且与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）以及其他物种中已知功能的ACR3转运蛋白具有高度同源性。这些蛋白都预测有10个跨膜结构域，并包含对砷转运功能至关重要的保守氨基酸残基。
为了探究HbACR3和HsACR3的功能，研究团队采用了功能互补实验。他们将这两个基因在对砷敏感的酿酒酵母arr3Δ突变体（其自身的砷外排泵基因已敲除）中进行异源表达。结果发现，表达HbACR3或HsACR3的酵母菌株，在面对亚砷酸盐（As(III)）和砷酸盐（As(V)）时，其耐受性得到了显著恢复，达到了与野生型酵母相似的水平。更重要的是，砷积累测定表明，表达这两种真菌ACR3蛋白的酵母细胞，其内部的砷含量显著低于只携带空载体的对照细胞，在50 μM和100 μM As(III)处理下，砷积累量降至对照的14%-18%。这直接证明了HbACR3和HsACR3具有将砷排出细胞的能力。
那么，这些转运蛋白位于细胞的什么位置以执行其外排功能呢？通过绿色荧光蛋白（GFP）标记和荧光显微镜观察，研究人员清晰地看到HbACR3和HsACR3与细胞膜标记共定位，表明它们主要分布在酵母的质膜上。这与它们作为砷外排泵，负责将细胞质中的砷离子“泵”出细胞外的功能是相符的。
回到蘑菇本身，当研究团队用砷酸盐（As(V)）处理H. bulbiferum和 H. sinapizans的菌丝体时，发现HbACR3和HsACR3基因的表达量被强烈诱导上调。特别是在10 μM As(V)浓度下，HsACR3的诱导表达量达到了约180倍，而HbACR3也达到了约104倍。然而，当砷浓度升高到100 μM时，两个基因的表达水平均大幅下降。这种表达模式提示，在较低砷胁迫下，ACR3介导的外排是主要的解毒机制；而在高浓度砷胁迫下，蘑菇可能启动了其他解毒途径，例如将砷甲基化成毒性较低的有机砷形式。研究数据也确实在菌丝体中检测到了有机砷物种的存在。
一个有趣的发现是，尽管HbACR3和HsACR3在异源系统中表现出几乎相同的转运效率和在质膜上的定位，但它们在各自来源菌株中的表达调控却存在差异。结合H. bulbiferum菌株表现出更高的砷积累能力这一现象，研究人员推测，这种表型差异可能并非源于ACR3蛋白本身功能的优劣，而是由于调控其表达的遗传元件（如启动子区域）不同所致。H. bulbiferum的HbACR3基因在砷诱导下的表达响应可能相对较弱，导致细胞内砷外排效率暂时性或基础水平上低于H. sinapizans，使得更多砷留在细胞内，进而可能为砷的甲基化等转化过程提供了底物，最终表现为更高的总砷积累。这为解释近缘物种间砷积累策略的分化提供了新的分子视角。
本研究成功地从两种Hebeloma属蘑菇中鉴定并功能表征了ACR3型砷外排转运蛋白。结果表明，HbACR3和HsACR3是定位于质膜的砷(III)外排泵，其表达受砷胁迫诱导，在降低细胞内砷积累、增强砷耐受性方面起着关键作用。这项研究不仅首次报道了大型真菌中的ACR3转运蛋白，加深了我们对真菌砷解毒机制的理解，也强调了ACR3转运蛋白在真菌应对砷污染环境中的普遍性和重要性。研究结果发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》期刊，为探索利用真菌进行环境砷生物修复或理解食用菌砷安全性提供了重要的理论基础和分子靶点。
主要关键技术方法
本研究综合利用了多种分子生物学和生理学技术。首先通过同源克隆和基因组步移技术从蘑菇菌丝体中获得了HbACR3和HsACR3基因的全长序列。核心功能分析通过在砷敏感型酿酒酵母arr3Δ突变体中进行异源表达互补实验完成，包括点板耐受性实验和细胞内砷含量测定（采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法，ICP-MS）。利用绿色荧光蛋白（GFP）标记与荧光显微镜观察，确定了蛋白的亚细胞定位。通过实时定量PCR（RT-qPCR）技术分析了蘑菇菌丝体在砷酸盐暴露下ACR3基因的表达变化。研究所用蘑菇样本（H. bulbiferum和 H. sinapizans）采集自捷克布拉格。
研究结果
HbACR3和HsACR3的异源表达恢复酵母砷耐受性并降低砷积累
在缺乏自身砷外排泵（ScARR3）的酿酒酵母突变体中表达HbACR3或HsACR3，能够使其在含有250 μM As(III)或500 μM As(V)的培养基上正常生长，恢复了对砷的耐受性。同时，这些酵母细胞的砷积累量显著降低，证实了这两个真菌ACR3蛋白具有功能性的砷外排活性。
HbACR3和HsACR3定位于酵母质膜
GFP融合蛋白的荧光显微镜观察显示，HbACR3和HsACR3与质膜标记共定位，明确其分布于细胞外周，这与它们作为质膜砷外排泵的功能定位一致。且GFP标记的蛋白仍保留其完整的砷耐受功能。
砷酸盐暴露诱导蘑菇菌丝体中ACR3基因表达
用不同浓度砷酸盐（As(V)）处理H. bulbiferum和 H. sinapizans的菌丝体，发现HbACR3和HsACR3基因的表达均被显著上调，尤其在10 μM As(V)时诱导效应最强，表明这些基因在蘑菇自身的砷应激响应中扮演重要角色。
研究结论与意义
本研究表明，ACR3型砷转运蛋白在Hebeloma属外生菌根蘑菇的砷解毒过程中发挥着核心作用。HbACR3和HsACR3作为质膜定位的砷(III)外排泵，能有效降低细胞内砷浓度，从而 confer （赋予）砷耐受性。这些蛋白在砷胁迫下的表达被强烈诱导，进一步印证了其生理重要性。该研究不仅首次在大型真菌中功能鉴定了ACR3转运蛋白，揭示了近缘蘑菇物种砷积累差异可能的转录调控基础，也凸显了ACR3机制在真菌界砷代谢中的广泛存在和关键进化地位。理解这些分子机制对于阐明真菌在全球砷生物地球化学循环中的作用、评估食用菌的砷安全风险以及开发基于真菌的生物修复策略均具有重要意义。
