基于L-鼠李糖基因编码生物传感器的海洋多糖解聚监测新方法及其应用

《Applied Microbiology and Biotechnology》：A genetically encoded L-rhamnose biosensor for monitoring marine polysaccharide depolymerization

本文介绍了一种基于转录因子的L-鼠李糖生物传感器，利用大肠杆菌天然PrhaBAD启动子实现对L-鼠李糖的特异性检测。该传感器在10–1000 μM浓度范围内呈现线性响应，并通过引入T7茎环结构优化性能。研究成功将其应用于评估石莼多糖降解级联反应中L-鼠李糖的释放，证实了其在复杂糖混合物中的适用性。该方法为海洋多糖的高通量降解分析提供了有效工具，在生物技术领域具有重要应用价值。

　　

全球气温上升和营养盐输入增加导致海洋藻华频发，其中石莼属绿藻引发的"绿潮"对渔业和旅游业造成严重影响。虽然藻类生物质的清除成本高昂，但这些废弃物却是食品、制药和生物精炼行业中珍贵代谢物和结构单元的可再生来源。石莼多糖作为石莼藻细胞壁的主要成分，占藻体干重的30%，其结构复杂且高度硫酸化，主要包含L-鼠李糖和D-葡萄糖醛酸等单糖。然而，目前缺乏高效分析复杂多糖酶解过程的方法，制约了藻类生物质的开发利用。

针对这一技术瓶颈，研究人员开发了一种基于转录因子的基因编码生物传感器，用于监测海洋多糖的解聚过程。该研究利用大肠杆菌天然的L-鼠李糖诱导型P_rhaBAD启动子系统，构建了能够特异性响应L-鼠李糖的生物传感器。研究人员对传感器系统进行了多重优化：引入T7茎环结构增强mRNA稳定性，测试了多种荧光报告基因（sfGFP、eGFP、mStayGold、mCherry），并评估了不同培养条件对传感器性能的影响。优化后的传感器在L-鼠李糖浓度10-1000 μM范围内呈现良好线性响应，且对石莼多糖降解过程中产生的其他单糖（如D-葡萄糖、D-半乳糖等）具有高度特异性。

关键技术方法包括：构建基于pCK302质粒的生物传感器系统，利用离子金属亲和色谱纯化重组酶，通过96孔板培养进行全细胞生物传感分析，采用标准曲线法定量L-鼠李糖浓度，并使用商业检测试剂盒验证结果可靠性。实验使用了来自北海、波罗的海和西班牙大西洋海岸的三个石莼藻生物质样本。

生物传感器性能优化

通过系统评估发现，引入T7 g10茎环结构的pCK302sl构建体表现最佳，荧光信号比原始版本提高近两倍。虽然对RhaS结合位点进行了工程化改造（pCK302sl_bind1和pCK302sl_bind2），但这些变体的性能反而下降，表明天然结合位点配置最为理想。在不同荧光蛋白报告中，sfGFP保持了最宽的检测范围（达1000 μM），而其他报告基因的检测上限均低于500 μM。

石莼多糖酶解监测

研究人员应用优化后的生物传感器监测了石莼多糖的酶解过程。实验采用了来自Formosa agariphila KMM 3901^T的PUL H系统中的六个关键酶：P10_PL40（石莼裂解酶）、P24_GH3（糖苷水解酶）、P31_GH39（糖苷水解酶）、P32_S1_8（硫酸酯酶）、P33_GH105（糖苷水解酶）和P36_S1_25（硫酸酯酶）。结果表明，只有在所有必需酶存在的情况下，生物传感器才能产生可检测的荧光信号，特别是硫酸酯酶P36_S1_25对L-鼠李糖的最终释放至关重要。这一发现证实了生物传感器能够特异性检测完全解聚后产生的游离L-鼠李糖，而不受中间产物的干扰。

藻类生物质直接降解分析

研究进一步将生物传感器应用于实际藻类生物质的降解分析。三个不同来源的石莼藻样本经过酶处理后，只有来自黑尔戈兰岛（北海）的样本显示出最高的L-鼠李糖释放量（286±8.9 μM），而商业样本和卢布明（波罗的海）样本的释放量较低。这种差异可能与不同藻类样本中石莼多糖的组成和硫酸化模式有关。

研究结论表明，这种基于RhaS转录因子的生物传感器为海洋多糖的高通量降解分析提供了可靠平台。与传统的色谱法和还原端测定法相比，该方法具有操作简便、成本低廉和高通量等优势。特别是在复杂糖混合物中，传感器能够特异性识别L-鼠李糖，而不受其他单糖的干扰。该技术不仅适用于石莼多糖降解过程的优化，还可扩展至其他藻类多糖的研究，为海洋生物质的增值利用提供了有力的分析工具。未来通过启动子工程、核糖体结合位点优化以及RhaS配体结合域的蛋白质工程，有望进一步提高传感器的检测灵敏度和适用范围。