酿酒酵母中纳米抗体-Fc融合蛋白的集成细胞与培养基工程策略：提升分泌表达与稳定性的综合研究

《Applied Microbiology and Biotechnology》：An integrated cell and medium engineering approach for production of a nanobody fusion in Saccharomyces cerevisiae

本文报道了一种集成细胞工程与培养基优化的创新策略，用于在酿酒酵母中高效生产纳米抗体-Fc融合蛋白。研究通过筛选并敲除VPS30、PEP1、ALG3等关键基因，结合富含氨基酸培养基及化学伴侣（如精氨酸、Tween-20）的添加，成功将抗体滴度提升20倍以上，达到2.5 μg/mL。该小规模补料分批培养系统为抗体快速表征提供了可行方案，对推动酵母表达系统在治疗性蛋白生产中的应用具有重要意义。

　　

在生物制药领域，治疗性蛋白的生产始终是研究热点。酿酒酵母作为一种传统的真核表达系统，虽已成功用于生产胰岛素、人生长激素等小分子蛋白，但对于抗体这类大分子量蛋白的表达却始终面临挑战——产量低、易降解、糖基化模式不理想等问题制约了其商业化应用。尤其值得注意的是，尽管单克隆抗体和Fc融合蛋白是生物药市场中增长最快的类别，但目前尚无由酿酒酵母生产的抗体药物获批上市。这背后的瓶颈主要在于分泌途径中的蛋白折叠、内质网应激、液泡分选错误以及分泌后蛋白被重新摄取降解等生物学过程。

为了解决这些难题，研究人员在《Applied Microbiology and Biotechnology》上发表了一项创新性研究，采用集成细胞工程和培养基优化的双管齐下策略，旨在提升酿酒酵母中纳米抗体-Fc融合蛋白的产量。纳米抗体是源自骆驼科动物的重链抗体可变区（VHH），其分子量小（<15 kDa）、稳定性高、溶解性好，且无需轻链配对即可形成完整的抗原结合域，这些特性使其成为理想的治疗剂候选。然而，当与人类免疫球蛋白的结晶片段（Fc）融合以延长半衰期和赋予效应功能时，表达量仍不尽如人意。

为开展研究，作者团队运用了多项关键技术：利用基因敲除技术（如基于Cre-loxP系统的删除与重复方法）构建了多个单基因及多基因缺失的酵母工程菌株；建立了24深孔板小规模补料分批培养系统，用于高通量筛选和优化培养条件；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测分泌抗体滴度；采用免疫印迹（Immunoblotting）分析蛋白完整性和糖基化状态；并利用lysozyme结合试验验证抗体的功能活性。

筛选靶基因以减少蛋白降解损失

研究人员首先筛选了可能影响蛋白降解的靶基因。结果表明，删除蛋白酶基因（如PEP4, YPS1）并未提高抗体滴度，而删除影响细胞内分选（VPS30, PEP1）、内吞作用（MON2）和细胞壁通透性（ALG3）的基因则显示出积极效果。其中，ΔMON2菌株的抗体滴度提升了23%，而ΔPEP1和ΔALG3缺失菌株在标准化细胞密度后滴度提升显著。

评估化学伴侣对生长和抗体生产的影响

研究测试了23种化学伴侣和渗透剂，发现精氨酸（15 mM）、Tween-20（0.0025%）和4-苯基丁酸（4-PBA, 0.25 mM）能显著提高抗体滴度，其中精氨酸和Tween-20的组合效果最佳，使滴度提升约40%。这些添加剂通过稳定蛋白结构、减少聚集和缓解内质网应激来发挥作用。

建立小规模补料分批培养协议

通过优化前培养基和诱导培养基成分，开发了一套24深孔板培养系统。该系统在诱导后48小时可使细胞密度（OD₆₀₀）达到45，抗体滴度达1.5 μg/mL。添加精氨酸和Tween-20后，滴度进一步提升至1.7 μg/mL。维持培养液pH值（通过添加Na₂CO₃）对蛋白稳定性至关重要。

优化生产菌株提高抗体滴度

将有益缺失（VPS30, PEP1, ALG3）组合，构建了多基因缺失菌株ΔVPS30ΔPEP1ΔALG3。该工程菌株的抗体滴度达到2.55 μg/mL，比对照菌株提高25%，且通过免疫印迹证实表达的抗体完整性良好，ALG3缺失还改变了N-糖基化谱，有利于糖工程改造。

酵母细胞生产功能性抗体

利用优化后的培养系统，研究人员成功表达了靶向溶菌酶的不同抗体格式（如全长IgG、scFv-Fc融合蛋白等）。功能验证实验（抗原-Fc ELISA）表明，工程菌株生产的抗体具有良好的抗原结合活性，证实了该平台可用于生产有功能的重组抗体。

研究结论与讨论部分强调，这种集细胞工程（基因敲除）、培养基优化（化学伴侣添加）和培养工艺开发（小规模补料分批）于一体的综合策略，有效地减少了蛋白降解损失，提高了抗体分泌效率。该研究不仅为在酿酒酵母中高效生产复杂抗体格式提供了可行方案，其建立的小规模培养平台还可用于抗体的快速筛选与表征，加速治疗性抗体的早期研发进程。值得注意的是，ALG3的缺失为后续糖基化工程改造奠定了基础，而针对内吞和分选途径的改造则凸显了细胞自身运输机制对重组蛋白产量的深刻影响。这项工作展示了酵母作为抗体生产平台的潜力，通过多靶点协同优化，有望弥补其与传统哺乳动物细胞表达系统之间的差距。