《Journal of Inflammation Research》：A Single-Cell Transcriptomic Atlas Elucidates a Microglial Gene Signature Linking Ferroptosis to Mitochondrial Dysfunction in Epilepsy
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本研究通过整合单细胞与bulk RNA测序数据，结合机器学习算法，首次系统阐明了癫痫中小胶质细胞铁死亡与线粒体功能障碍的分子桥梁——ATM、TGFBR1、ZEB1、PARP14、GJA1和ALOX5六个关键基因。这些基因不仅与神经炎症、免疫浸润（如Th1细胞升高、CD8+ T细胞减少）密切相关，还富集于NF-κB、JAK-STAT等致痫通路。实验验证证实PARP14在癫痫大鼠中上调，且GJA1与博来霉素存在稳定结合，为靶向治疗提供了新策略。
单细胞转录组图谱揭示癫痫病理机制
本研究通过整合癫痫和对照样本的单细胞核RNA测序（snRNA-seq）和批量RNA测序（bulk RNA-seq）数据，系统绘制了癫痫的单细胞转录组图谱，旨在阐明铁死亡（ferroptosis）和线粒体功能障碍在癫痫进展中的相互作用及其细胞特异性机制。
数据整合与细胞分群
研究人员对数据集进行质量控制后，共保留41,218个细胞。通过主成分分析（PCA）和Harmony整合去除批次效应，再利用均匀流形近似与投影（UMAP）进行非线性降维，最终识别出13个细胞亚群，并将其注释为7种主要细胞类型：少突胶质前体细胞（OPC）、少突胶质细胞、抑制性神经元、兴奋性神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞。
小胶质细胞是铁死亡的关键细胞类型
为了评估不同细胞类型中铁死亡活动的异质性，研究团队采用AUCell、UCell、singscore、ssGSEA和AddModuleScore五种计算方法对铁死亡相关基因（FRGs）集进行评分。结果发现，小胶质细胞中的铁死亡评分显著高于其他细胞类型，并且在癫痫组中明显上调。通过差异表达分析，在癫痫小胶质细胞中鉴定出606个差异表达基因（DEGs），其中20个与已知的484个FRGs存在交集，提示小胶质细胞是癫痫中铁死亡过程的关键效应细胞。
机器学习筛选连接铁死亡与线粒体功能障碍的核心基因
研究进一步从MitoCarta3.0数据库中获取了1136个线粒体相关基因（MRGs），并利用单样本基因集富集分析（ssGSEA）评估样本的线粒体通路活性。通过相关性分析，发现上述20个交集基因中有12个（ALOX5、ATM、BACH1、CYBB、GJA1、HMOX1、JUN、PARP8、PARP14、TGFBR1、TLR4和ZEB1）的表达与线粒体功能评分显著相关。随后，应用三种机器学习算法进行关键基因筛选：LASSO回归筛选出7个基因，随机森林（RF）算法选出前10个重要基因，支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）在包含9个特征基因时达到最高分类精度。三种算法的交集最终确定了六个核心基因：ATM、TGFBR1、ZEB1、PARP14、GJA1和ALOX5，它们构成了连接小胶质细胞铁死亡与线粒体功能障碍的基因特征。
免疫微环境特征
免疫浸润分析显示，与对照组相比，癫痫样本中抗原呈递细胞（APC）共刺激和Th1细胞水平显著升高，而CD8+T细胞丰度降低。相关性分析表明，这六个核心基因的表达与多种免疫细胞浸润和免疫因子（如细胞因子、受体、MHC分子、免疫抑制因子和免疫刺激因子）显著相关，提示它们可能通过调节神经免疫微环境参与癫痫的发病过程。
通路富集与转录调控
基因集富集分析（GSEA）揭示了核心基因涉及的关键信号通路。例如，ATM富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、抗原加工呈递和Toll样受体信号通路；TGFBR1和PARP14与NF-κB信号通路相关；ZEB1和GJA1与JAK-STAT信号通路相关；GJA1和ALOX5则与铁死亡通路密切相关。基因集变异分析（GSVA）进一步表明，高表达这些基因的样本在干扰素-α反应、干扰素-γ反应等免疫相关通路上显著富集。此外，转录调控网络分析确定了核心基因上游的显著富集转录因子结合基序，其中cisbp__M1271基序（NES: 5.72）得分最高。
单细胞表达与免疫代谢特征
在单细胞水平上，基因表达模式分析显示，PARP14、ATM、TGFBR1和ALOX5在小胶质细胞中高表达。通过AUCell量化免疫代谢通路活性发现，与这些基因相关的信号通路，如Notch信号、有丝分裂纺锤体和PI3K-Akt-mTOR信号通路，在癫痫样本中活性显著改变。
药物靶点预测与分子对接
利用药物-基因相互作用数据库（DGIdb）预测了可能与核心基因相互作用的药物，例如GJA1对应的博来霉素（bleomycin）。分子对接结果显示GJA1与博来霉素具有较高的结合亲和力（结合能为-6.0 kcal/mol）。进一步的分子动力学（MD）模拟（持续100 ns）表明，GJA1-博来霉素复合物在模拟后期（>60,000 ps）结构趋于稳定，RMSD、回转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）等参数收敛，氢键占据稳定，证实了二者结合构象的稳定性。
体内实验验证
通过在锂-匹鲁卡品诱导的癫痫大鼠模型中进行组织病理学验证，发现癫痫大鼠海马齿状回（DG）、CA1和CA3区神经元出现明显丢失、核固缩、细胞间隙增宽等病理改变。普鲁士蓝染色显示癫痫大鼠脑内存在铁沉积。透射电镜（TEM）观察发现癫痫大鼠海马线粒体出现膜密度增加、嵴断裂、肿胀空泡化等超微结构损伤。JC-1荧光染色显示癫痫组线粒体膜电位（ΔΨm）崩溃，JC-1单体（绿色）增加，聚合物（红色）减少。免疫组化（IHC）结果证实，癫痫大鼠海马各区域（DG、CA1、CA3）的PARP14蛋白表达均显著高于对照组，与生物信息学分析结果一致。
讨论与意义
本研究首次通过单细胞转录组技术结合机器学习，在癫痫背景下系统揭示了小胶质细胞中连接铁死亡和线粒体功能障碍的六个关键基因（ATM、TGFBR1、ZEB1、PARP14、GJA1和ALOX5）。其中，PARP14是首次被报道与癫痫发生相关。这些基因通过调节神经炎症、免疫细胞浸润以及多条关键信号通路（如NF-κB、JAK-STAT、铁死亡等）共同促进癫痫进程。药物靶点预测和分子对接为靶向GJA1等分子的抗癫痫药物研发（如博来霉素）提供了新思路。实验验证证实了癫痫模型中存在铁死亡、线粒体损伤以及PARP14的上调。该研究为理解癫痫的细胞特异性机制提供了新见解，并提出了潜在的治疗靶点。
