《Heliyon》：Cytotoxic activity of pyrimethanil on human testicular teratocarcinoma NT2/D1 cells
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本研究针对新型杀菌剂嘧霉胺（Pyrimethanil）对人体潜在健康风险关注不足的现状，系统评估了其对人类睾丸畸胎癌NT2/D1细胞的毒性效应。研究人员通过细胞形态学观察、活性氧检测、凋亡标志物分析等技术手段，首次揭示嘧霉胺通过诱导氧化应激（ROS）激活p53/cleaved Caspase-3信号通路，进而引发剂量依赖性细胞凋亡的分子机制。该发现为评估嘧霉胺的生殖毒性风险提供了重要实验依据，对农药安全使用标准制定具有警示意义。
在现代农业保障作物产量的斗争中，杀菌剂扮演着不可或缺的角色。然而，这些化学物质在完成其使命后，残留物可能通过土壤、水源甚至食物链进入生态系统，对非靶标生物乃至人类健康构成潜在威胁。嘧霉胺（Pyrimethanil）作为一种新一代的苯胺基嘧啶类杀菌剂，被广泛用于防治果蔬采前采后病害，特别是在葡萄种植中用于对抗灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的腐烂。尽管其杀菌功效显著，但关于嘧霉胺对人类细胞，尤其是生殖系统相关细胞的毒性作用及其深层机制，科学界知之甚少。更令人担忧的是，环境监测数据显示，嘧霉胺是欧洲及澳大利亚等地水体中常被检出的杀菌剂之一，甚至在婴幼儿食品和瓶装水中也发现了其踪迹。这种广泛的残留现状与其毒理学研究相对滞后的矛盾，使得深入探究嘧霉胺的生物安全性变得尤为紧迫。
为了填补这一知识空白，一项发表在《Heliyon》杂志上的研究将目光投向了人类睾丸畸胎癌NT2/D1细胞系。选择这一细胞模型并非偶然，因为睾丸是环境毒素易感的重要靶器官，而NT2/D1细胞作为多能性细胞，为研究化合物对生殖细胞早期发育的潜在影响提供了有价值的体外模型。研究人员旨在系统阐明嘧霉胺是否对这类细胞产生毒性效应，并深入探索其潜在的分子作用机制，从而为全面评估嘧霉胺的潜在健康风险提供科学证据。
研究人员开展本研究主要运用了几个关键技术方法：采用结晶紫染色法评估嘧霉胺处理后的细胞存活率，以确定其细胞毒性效应；通过免疫细胞化学技术检测细胞骨架蛋白（微管蛋白和F-actin）的表达与分布，观察细胞形态学变化；使用DCFH-DA荧光探针法定量分析细胞内活性氧（ROS）水平，以评估氧化应激程度；通过流式细胞术结合Annexin V/PI双染法区分凋亡与坏死细胞；利用免疫荧光染色检测凋亡关键蛋白p53和cleaved Caspase-3的表达与定位；并采用衰老相关β-半乳糖苷酶染色法鉴定细胞衰老情况。所有实验均使用人睾丸畸胎癌NT2/D1细胞系（ATCC? CRL-1973?）进行。
3.1 嘧霉胺对NT2/D1细胞的细胞毒性作用
研究结果清晰表明，嘧霉胺对NT2/D1细胞具有显著的剂量依赖性细胞毒性。通过结晶紫染色发现，用50 ng/μl的嘧霉胺处理24小时后，细胞数量减少了约20%；当浓度升高至150 ng/μl和300 ng/μl时，细胞数量分别急剧减少约80%和90%。这一结果直观地证明了嘧霉胺能有效抑制NT2/D1细胞的增殖或存活。
3.2 嘧霉胺以剂量依赖性方式诱导NT2/D1细胞形态学变化
为了探究嘧霉胺对细胞结构的影响，研究人员通过鬼笔环肽（标记F-actin）和抗微管蛋白抗体染色观察细胞骨架的变化。研究发现，与对照组相比，即使低浓度（50 ng/μl）的嘧霉胺也能导致鬼笔环肽染色强度显著降低，表明细胞骨架中的肌动蛋白纤维受到影响。随着嘧霉胺浓度增加（150 ng/μl和300 ng/μl），鬼笔环肽的表达进一步下降。同时，微管蛋白染色显示，经中、高浓度嘧霉胺处理的细胞形态变得细长，与对照组细胞形态差异明显。这些形态学改变提示嘧霉胺干扰了细胞的正常骨架结构和形态维持。
3.3 嘧霉胺诱导NT2/D1细胞凋亡
细胞死亡方式的研究是理解化合物毒性的关键。通过Annexin V/PI流式细胞术分析发现，嘧霉胺处理2小时仅引起轻微的细胞毒性（300 ng/μl浓度下约15%细胞死亡），而延长处理时间至24小时后，其毒性效应大幅增强，300 ng/μl嘧霉胺导致近90%的细胞死亡，且死亡方式主要为凋亡。为了确认凋亡途径的激活，研究人员检测了两个关键的凋亡标志物：p53和cleaved Caspase-3。免疫荧光结果显示，在150 ng/μl和300 ng/μl嘧霉胺处理组中，cleaved Caspase-3的表达被明显诱导，而在对照组和50 ng/μl组中几乎检测不到。p53在所有实验组中均有表达，但其阳性细胞的比例随嘧霉胺浓度增加而升高。这些证据共同表明，嘧霉胺能剂量依赖性地激活p53和Caspase-3通路，从而引发NT2/D1细胞的程序性死亡。
3.4 嘧霉胺诱导NT2/D1细胞产生活性氧（ROS）
氧化应激是许多农药发挥毒性的常见机制。采用DCFH-DA荧光法检测细胞内ROS水平发现，嘧霉胺处理能显著升高NT2/D1细胞内的ROS水平，且呈现明显的剂量效应关系。50 ng/μl、150 ng/μl和300 ng/μl的嘧霉胺分别使ROS产量增加了约5%、20%和70%。最高浓度下的ROS暴增与最严重的细胞凋亡程度相一致，提示嘧霉胺诱导的氧化应激可能是触发凋亡的上游事件。
3.5 嘧霉胺对NT2/D1细胞衰老无显著影响
为了排除嘧霉胺通过诱导细胞衰老发挥作用的可能性，研究人员进行了衰老相关β-半乳糖苷酶染色。结果表明，与对照组相比，不同浓度的嘧霉胺处理并未显著增加β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量。这一结果将嘧霉胺的细胞效应明确指向凋亡，而非衰老途径。
综合以上研究结果可以得出结论，嘧霉胺在体外能对人睾丸畸胎癌NT2/D1细胞产生显著的毒性效应。其作用机制涉及诱导细胞内活性氧（ROS）水平升高，进而可能通过线粒体途径激活p53和Caspase-3，最终导致细胞凋亡。这种毒性效应具有剂量依赖性，并且不涉及细胞衰老途径的激活。该研究首次系统揭示了嘧霉胺对人类睾丸来源细胞的潜在危害及其分子机制，为全面认识这类广泛使用的杀菌剂的生物安全性提供了重要的毒理学证据。研究结果强调，在享受嘧霉胺带来的农业效益的同时，必须高度重视其可能对生殖健康构成的潜在风险，尤其是考虑到其在环境中的残留和生物累积性。未来需要更多研究来阐明嘧霉胺的作用是否具有细胞或组织特异性，并进一步评估其整体收益与潜在危害之间的平衡关系，为制定更安全的农药使用指南和环境保护政策提供科学依据。
